रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्टेज)। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्टेज) कौन सी प्रक्रिया एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करती है

रेट्रोवायरस का अध्ययन करते समय, जिसके जीनोम को एकल-फंसे आरएनए अणुओं द्वारा दर्शाया जाता है, यह पाया गया कि इंट्रासेल्युलर विकास की प्रक्रिया में वे अपने जीनोम को डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के रूप में मेजबान के गुणसूत्रों में एकीकृत करने के चरण से गुजरते हैं। कक्ष। 1964 में, X. Temin ने RNA टेम्प्लेट पर पूरक डीएनए को संश्लेषित करने में सक्षम वायरस-विशिष्ट एंजाइम के अस्तित्व के बारे में एक परिकल्पना को सामने रखा। 1970 में, X. Temin और S. Mizutani, साथ ही स्वतंत्र रूप से D. Baltimore, ने बाह्य कोशिकीय रौस सार्कोमा वायरस विषाणुओं की तैयारी में इस तरह के एक एंजाइम की खोज की। इस आरएनए-निर्भर डीएनए पोलीमरेज़ को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस) कहा जाता है।

एवियन रेट्रोवायरस के रिवर्टेज का सबसे विस्तार से अध्ययन किया गया है। प्रत्येक विषाणु में इस एंजाइम के लगभग 50 अणु होते हैं। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में दो सबयूनिट होते हैं, (65 केडीए) और β (95 केडीए), जो कि समतुल्य मात्रा में मौजूद होते हैं। -सबयूनिट β-सबयूनिट का एन-टर्मिनल भाग (दो तिहाई) है।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में कम से कम तीन एंजाइमेटिक गतिविधियां होती हैं:

डीएनए पोलीमरेज़, आरएनए और डीएनए दोनों को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए;

RNase H की गतिविधि, जो RNA-DNA हाइब्रिड में RNA को हाइड्रोलाइज़ करती है, लेकिन सिंगल- या डबल-स्ट्रैंडेड RNA नहीं;

डीएनए एंडोन्यूक्लिज।

वायरल डीएनए संश्लेषण के लिए पहले दो गतिविधियों की आवश्यकता होती है, और एंडोन्यूक्लिज़ वायरल डीएनए के मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। रिवर्सटेज़ के β-सबयूनिट में तीनों गतिविधियाँ होती हैं, जबकि -सबयूनिट में केवल पोलीमरेज़ और RNase H होता है।

शुद्ध रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए और डीएनए टेम्प्लेट दोनों पर डीएनए को संश्लेषित करता है। संश्लेषण शुरू करने के लिए, अन्य पोलीमरेज़ की तरह, रिवर्सटेज़ को एक छोटे डबल-स्ट्रैंडेड क्षेत्र की आवश्यकता होती है - एक प्राइमर। प्राइमर आरएनए और डीएनए दोनों का एकल-फंसे खंड हो सकता है, जो प्रतिक्रिया के दौरान नए संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड से सहसंयोजक बन जाते हैं।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग मुख्य रूप से मैसेंजर आरएनए को पूरक डीएनए (सीडीएनए) में बदलने के लिए किया जाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया RNase गतिविधि के मजबूत अवरोधकों की उपस्थिति में की जाती है। इस मामले में, लक्ष्य आरएनए अणुओं की पूर्ण लंबाई वाली डीएनए प्रतियां प्राप्त करना संभव है। ओलिगो (डीटी) का उपयोग पॉली (ए)-युक्त एमआरएनए (छवि) के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए प्राइमर के रूप में किया जाता है, और आरएनए अणुओं के लिए जिसमें 3 "पॉली (ए) सिरों नहीं होते हैं, रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स 3" छोर के पूरक होते हैं। आरएनए का अध्ययन किया। इसके अलावा, बाद के प्रकार के आरएनए अणुओं को ई. कोलाई पॉली (ए) पोलीमरेज़ का उपयोग करके पॉली (ए)-युक्त में परिवर्तित किया जा सकता है।

पूरक डीएनए स्ट्रैंड के एमआरएनए पर संश्लेषण और आरएनए के विनाश (आमतौर पर क्षार उपचार का उपयोग किया जाता है) के बाद, दूसरे डीएनए स्ट्रैंड का संश्लेषण किया जाता है। इस मामले में, एकल-फंसे सीडीएनए के 3 "सिरों पर स्व-पूरक हेयरपिन बनाने के लिए रिवर्सटेज़ की क्षमता का उपयोग किया जाता है, जो एक प्राइमर के रूप में कार्य कर सकता है। सीडीएनए का पहला किनारा एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। इस प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित किया जा सकता है। रिवर्सटेज़ और ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ I दोनों द्वारा। इन दो एंजाइमों के संयोजन से पूर्ण विकसित डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए अणुओं की उपज में वृद्धि होती है।

संश्लेषण के पूरा होने पर, सीडीएनए के पहले और दूसरे स्ट्रैंड एक हेयरपिन लूप द्वारा सहसंयोजक रूप से जुड़े रहते हैं, जो दूसरे स्ट्रैंड के संश्लेषण में प्राइमर के रूप में कार्य करता है। इस लूप को S1 एंडोन्यूक्लाइज से साफ किया जाता है, जो विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के एकल-फंसे क्षेत्रों को नष्ट कर देता है। परिणामी सिरे हमेशा कुंद नहीं होते हैं, और बाद की क्लोनिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए, उन्हें ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ I के क्लेनो खंड का उपयोग करके कुंद करने के लिए मरम्मत की जाती है। परिणामी डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए को फिर क्लोनिंग वैक्टर में डाला जा सकता है, हाइब्रिड डीएनए अणुओं के रूप में प्रचारित किया जाता है, और आगे के शोध के लिए उपयोग किया जाता है।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्सटेज़ या आरएनए-आश्रित डीएनए पोलीमरेज़) एक एंजाइम है जो एक आरएनए टेम्पलेट पर डीएनए के संश्लेषण को एक प्रक्रिया में उत्प्रेरित करता है जिसे "कहा जाता है" रिवर्स प्रतिलेखन". प्रक्रिया का नाम प्रक्रिया के विपरीत को दर्शाता है ट्रांसक्रिप्शनदूसरी दिशा में किया गया: एक डीएनए टेम्पलेट अणु से एक आरएनए प्रतिलेख संश्लेषित किया जाता है।

इन एंजाइमों को आरएनए वायरस से अलग किया गया है ( रेट्रोवायरस) डीएनए के पूरक स्ट्रैंड में mRNA को ट्रांसक्रिप्ट करने के लिए ट्यूमर वायरस द्वारा रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाता है। रेट्रोवायरस का अध्ययन करते समय, जिसके जीनोम को एकल-फंसे आरएनए अणुओं द्वारा दर्शाया जाता है, यह पाया गया कि इंट्रासेल्युलर विकास की प्रक्रिया में, एक रेट्रोवायरस अपने जीनोम को डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के रूप में गुणसूत्रों में एकीकृत करने के चरण से गुजरता है। मेजबान सेल। 1964 में, टेमिन ने एक आरएनए टेम्पलेट पर पूरक डीएनए को संश्लेषित करने में सक्षम वायरस-विशिष्ट एंजाइम के अस्तित्व के बारे में एक परिकल्पना को सामने रखा। इस तरह के एक एंजाइम को अलग करने के उद्देश्य से प्रयास सफल रहे, और 1970 में टेमिन और मिज़ुतानी, साथ ही साथ स्वतंत्र रूप से, बाल्टीमोर ने बाह्य कोशिकीय रौस सार्कोमा वायरस विषाणुओं की तैयारी में वांछित एंजाइम की खोज की। इस आरएनए-निर्भर डीएनए पोलीमरेज़ को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस या रिवर्टेज़ कहा जाता है।

एवियन रेट्रोवायरस के रिवर्टेज का सबसे विस्तार से अध्ययन किया गया है। प्रत्येक विषाणु में इस एंजाइम के लगभग 50 अणु होते हैं। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में दो सबयूनिट होते हैं, ए (65 केडीए) और बी (95 केडीए), जो समतुल्य मात्रा में मौजूद होते हैं। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में कम से कम तीन एंजाइमेटिक गतिविधियां होती हैं:

1) डीएनए पोलीमरेज़, आरएनए और डीएनए दोनों को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए;

2) आरएनएस एच की गतिविधि, जो आरएनए-डीएनए हाइब्रिड के हिस्से के रूप में आरएनए को हाइड्रोलाइज करती है;

3) डीएनए एंडोन्यूक्लिज गतिविधि।

वायरल डीएनए संश्लेषण के लिए पहले दो गतिविधियों की आवश्यकता होती है, और एंडोन्यूक्लिज़ वायरल डीएनए के मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। शुद्ध रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए और डीएनए टेम्प्लेट दोनों पर डीएनए को संश्लेषित करता है (चित्र 11)।

चावल। 11. आरएनए अणुओं की डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए प्रतियों के संश्लेषण की योजना

संश्लेषण शुरू करने के लिए, अन्य पोलीमरेज़ की तरह, रिवर्सटेज़ को एक छोटे डबल-स्ट्रैंडेड क्षेत्र (प्राइमर) की आवश्यकता होती है। प्राइमर आरएनए और डीएनए दोनों का एकल-फंसे खंड हो सकता है, जो प्रतिक्रिया के दौरान नए संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड से सहसंयोजक बन जाते हैं। आनुवंशिक इंजीनियरिंग में, दोनों ओलिगो-(डीटी) प्राइमर एमआरएनए के 3'-पॉलीए सिरों के पूरक हैं और संरचना और अनुक्रम (यादृच्छिक प्राइमर) में हेक्सान्यूक्लियोटाइड्स "यादृच्छिक" का एक सेट उपयोग किया जाता है। अक्सर ज्ञात प्राथमिक अनुक्रम वाले आरएनए अणुओं के लिए 3'- पॉली (ए) सिरे नहीं होते हैं, रासायनिक रूप से संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग 3 "अंत" के पूरक के रूप में करते हैं

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग मुख्य रूप से मैसेंजर आरएनए को पूरक डीएनए (सीडीएनए) में बदलने के लिए किया जाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया RNase गतिविधि के मजबूत अवरोधकों का उपयोग करके विशेष रूप से चयनित परिस्थितियों में की जाती है। इस मामले में, लक्ष्य आरएनए अणुओं की पूर्ण लंबाई वाली डीएनए प्रतियां प्राप्त करना संभव है। पूरक डीएनए स्ट्रैंड के एमआरएनए पर संश्लेषण और आरएनए के विनाश (क्षारीय उपचार आमतौर पर उपयोग किया जाता है) के बाद, दूसरे डीएनए स्ट्रैंड का संश्लेषण किया जाता है। इस मामले में, एकल-फंसे सीडीएनए के 3' सिरों पर स्व-पूरक हेयरपिन बनाने के लिए रिवर्सटेज़ की क्षमता का उपयोग किया जाता है, जो एक प्राइमर के रूप में कार्य कर सकता है।

टेम्पलेट सीडीएनए का पहला किनारा है। इस प्रतिक्रिया को रिवर्टेज और ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ I दोनों द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि इन दो एंजाइमों का संयोजन पूर्ण डबल-फंसे सीडीएनए अणुओं की उपज को बढ़ाना संभव बनाता है। संश्लेषण के पूरा होने पर, सीडीएनए के पहले और दूसरे स्ट्रैंड एक हेयरपिन लूप द्वारा सहसंयोजक रूप से जुड़े रहते हैं, जो दूसरे स्ट्रैंड के संश्लेषण में प्राइमर के रूप में कार्य करता है। इस लूप को S1 एंडोन्यूक्लाइज से साफ किया जाता है, जो विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के एकल-फंसे क्षेत्रों को नष्ट कर देता है। परिणामी सिरे हमेशा कुंद नहीं होते हैं, और बाद की क्लोनिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए, उन्हें ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ I के क्लेनो खंड का उपयोग करके कुंद करने के लिए मरम्मत की जाती है। परिणामी डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए को फिर क्लोनिंग वैक्टर में डाला जा सकता है, हाइब्रिड डीएनए अणुओं के रूप में प्रचारित किया जाता है, और आगे के शोध के लिए उपयोग किया जाता है।

रिवर्टेज एक एंजाइम है जो आरएनए टेम्पलेट पर सीडीएनए को संश्लेषित करता है।

कुछ वायरस में, जीनोम हमेशा की तरह डीएनए नहीं है, बल्कि आरएनए है। ऐसे वायरस को रेट्रोवायरस (रेट्रो-रिवर्स) कहा जाता था। 1970 में, डी. बाल्टीमोर और एच.एम. टेमिन ने वायरल आरएनए से डीएनए में सूचना स्थानांतरित करने के लिए एक तंत्र की खोज की, अर्थात। कोशिकाओं में जो होता है उसके विपरीत उच्च जीव. इस प्रक्रिया को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन कहा जाता है, और इसे करने वाले एंजाइम को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस या रिवर्टेज कहा जाता है।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, या रिवर्टेज (रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, [lat. प्रतिलिपि- पुनर्लेखन) - एंजाइम आरएनए-निर्भर डीएनए पोलीमरेज़, जिसकी मदद से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया जाता है - आरएनए टेम्पलेट पर डीएनए संश्लेषण; कुछ आरएनए युक्त वायरस और उच्च जीवों के जीनोम के मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के जीनोम द्वारा एन्कोड किया गया, आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक महत्वपूर्ण "उपकरण"। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में कम से कम तीन एंजाइमेटिक गतिविधियां होती हैं:

1) डीएनए पोलीमरेज़, आरएनए और डीएनए दोनों को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए;

2) आरएनएस एच की गतिविधि, जो आरएनए-डीएनए हाइब्रिड में आरएनए को हाइड्रोलाइज करती है, लेकिन सिंगल- या डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए नहीं, और

3) डीएनए एंडोन्यूक्लिज गतिविधि।

1970 में डी. बाल्टीमोर और एच. टेमिन द्वारा स्वतंत्र रूप से आरएनए युक्त ट्यूमर वायरस (1975 का नोबेल पुरस्कार, आर. डल्बेको के साथ मिलकर) में खोजा गया।

इस प्रकार, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस चार डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट को पोलीमराइज़ करके आरएनए टेम्पलेट पर डीएनए को संश्लेषित करने में सक्षम हैं। और डीएनए पोलीमरेज़ की तरह, वे केवल एक बीज की उपस्थिति में कार्य करते हैं।

सीडीएनए लाइब्रेरी (क्लोनोटेक) प्राप्त करने के लिए प्लास्मिड वैक्टर में इसके बाद के क्लोनिंग के लिए आरएनए (विशेष रूप से एमआरएनए) के पूरक डबल-फंसे डीएनए के संश्लेषण में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, जैसे डीएनए पोलीमरेज़, का उपयोग डीएनए जांच में एक रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंट लेबल को उपयुक्त रूप से लेबल किए गए डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट में पेश करने के लिए किया जा सकता है।

थर्मोस्टेबल थर्मस थर्मोफिलस डीएनए पोलीमरेज़ के लिए कुछ शर्तों के तहत आरएनए टेम्पलेट से डीएनए को संश्लेषित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया गया है। यह पीसीआर द्वारा जैविक नमूनों में विशिष्ट आरएनए के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए इसका उपयोग करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण के आधुनिक संशोधन एक प्रतिक्रिया मिश्रण (और टेस्ट ट्यूब) में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में संश्लेषित करने के लिए संभव बनाते हैं, आरएनए टेम्पलेट पर प्रवर्धित डीएनए टुकड़े की एक छोटी संख्या की प्रतियां, जो तुरंत उसी एंजाइम द्वारा टेम्पलेट के रूप में उपयोग की जाती हैं पारंपरिक पीसीआर (एक ट्यूब पीसीआर) में।