Käänteinen transkriptaasi (revertaasi). Käänteiskopioijaentsyymi (revertaasi) Mikä prosessi käyttää käänteiskopioijaentsyymiä

Tutkittaessa retroviruksia, joiden genomia edustavat yksijuosteiset RNA-molekyylit, havaittiin, että solunsisäisessä kehitysprosessissa ne käyvät läpi vaiheen, jossa genominsa integroituu kaksijuosteisen DNA:n muodossa isännän kromosomeihin. solu. Vuonna 1964 X. Temin esitti hypoteesin virusspesifisen entsyymin olemassaolosta, joka kykenee syntetisoimaan komplementaarista DNA:ta RNA-templaatissa. Vuonna 1970 X. Temin ja S. Mizutani sekä itsenäisesti D. Baltimore löysivät tällaisen entsyymin ekstrasellulaaristen Rous-sarkoomaviruksen virionien valmisteessa. Tätä RNA-riippuvaista DNA-polymeraasia kutsutaan käänteiskopioijaksi (käänteistranskriptaasi).

Lintujen retrovirusten revertaasi on tutkittu yksityiskohtaisimmin. Jokainen virioni sisältää noin 50 molekyyliä tätä entsyymiä. Käänteistranskriptaasi koostuu kahdesta alayksiköstä, ά (65 kDa) ja β (95 kDa), joita on läsnä ekvimolaarisina määrinä. ά-alayksikkö on β-alayksikön N-terminaalinen osa (kaksi kolmasosaa).

Käänteistranskriptaasilla on vähintään kolme entsymaattista aktiivisuutta:

DNA-polymeraasi käyttäen sekä RNA:ta että DNA:ta templaattina;

RNaasi H:n aktiivisuus, joka hydrolysoi RNA:ta RNA-DNA-hybridissä, mutta ei yksi- tai kaksijuosteista RNA:ta;

DNA-endonukleaasi.

Kaksi ensimmäistä aktiivisuutta tarvitaan viruksen DNA-synteesiin, ja endonukleaasi näyttää olevan tärkeä virus-DNA:n integroitumiselle isäntäsolun genomiin. Reversetaasin β-alayksiköllä on kaikki kolme aktiivisuutta, kun taas ά-alayksikössä on vain polymeraasi ja RNaasi H.

Puhdistettu käänteistranskriptaasi syntetisoi DNA:ta sekä RNA- että DNA-templaateilla. Synteesin aloittamiseksi reversetaasi, kuten muutkin polymeraasit, tarvitsee lyhyen kaksijuosteisen alueen - alukkeen. Aluke voi olla sekä RNA:n että DNA:n yksijuosteinen segmentti, joka reaktion aikana sitoutuu kovalenttisesti vasta syntetisoituun DNA-juosteeseen.

Käänteistranskriptaasia käytetään pääasiassa transkriptoimaan lähetti-RNA:ta komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA). Käänteistranskriptioreaktio suoritetaan voimakkaiden RNaasi-aktiivisuuden estäjien läsnä ollessa. Tässä tapauksessa on mahdollista saada täyspitkiä DNA-kopioita kohde-RNA-molekyyleistä. Oligo(dT):tä käytetään alukkeena poly(A):ta sisältävän mRNA:n käänteistranskriptiossa (kuva) ja RNA-molekyyleille, joilla ei ole 3" poly(A)-päitä, kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, jotka ovat komplementaarisia 3" pään kanssa. tutkinut RNA:ta. Lisäksi jälkimmäisen tyypin RNA-molekyylejä voidaan muuntaa poly(A)-pitoisiksi käyttämällä E. colin poly(A)-polymeraasia.

Komplementaarisen DNA-juosteen synteesin mRNA:lla ja RNA:n tuhoutumisen jälkeen (yleensä käytetään alkalikäsittelyä) syntetisoidaan toinen DNA-juoste. Tässä tapauksessa käytetään reversetaasin kykyä muodostaa itseään täydentäviä hiusneuloja yksijuosteisen cDNA:n 3" päihin, jotka voivat toimia alukkeena. Ensimmäinen cDNA-juoste toimii templaattina. Tämä reaktio voidaan katalysoida sekä reversetaasilla että E. colin DNA-polymeraasi I:llä. Näiden kahden entsyymin yhdistelmä mahdollistaa täysimittaisten kaksijuosteisten cDNA-molekyylien saannon lisäämisen.

Synteesin päätyttyä cDNA:n ensimmäinen ja toinen juoste pysyvät kovalenttisesti kytkettyinä hiusneulasilmukalla, joka toimi alukkeena toisen juosteen synteesissä. Tämä silmukka katkaistaan ​​S1-endonukleaasilla, joka spesifisesti tuhoaa nukleiinihappojen yksijuosteisia alueita. Tuloksena olevat päät eivät aina ole tylsiä, ja myöhemmän kloonauksen tehokkuuden lisäämiseksi ne korjataan tylsiksi käyttämällä E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia. Tuloksena oleva kaksijuosteinen cDNA voidaan sitten insertoida kloonausvektoreihin, lisätä hybridi-DNA-molekyyleinä ja käyttää jatkotutkimukseen.

Käänteinen transkriptaasi (reversetaasi tai RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi) on entsyymi, joka katalysoi DNA:n synteesiä RNA-templaatissa prosessissa nimeltä " käänteinen transkriptio". Prosessin nimi kuvastaa prosessin vastakohtaa transkriptioita suoritetaan toiseen suuntaan: RNA-transkripti syntetisoidaan DNA-templaattimolekyylistä.

Nämä entsyymit on eristetty RNA-viruksista ( retrovirukset). Kasvainvirukset käyttävät käänteistranskriptaasia transkriptoimaan mRNA:ta komplementaariseksi DNA-juosteeksi. Tutkittaessa retroviruksia, joiden genomia edustavat yksijuosteiset RNA-molekyylit, havaittiin, että solunsisäisen kehitysprosessin aikana retrovirus käy läpi vaiheen, jossa sen genomi integroituu kaksijuosteisen DNA:n muodossa solun kromosomeihin. isäntäsolu. Vuonna 1964 Temin esitti hypoteesin virusspesifisen entsyymin olemassaolosta, joka kykenee syntetisoimaan komplementaarista DNA:ta RNA-templaatissa. Yritykset eristää tällainen entsyymi kruunasivat menestyksen, ja vuonna 1970 Temin ja Mizutani sekä Baltimore heistä riippumatta löysivät halutun entsyymin ekstrasellulaaristen Rous-sarkoomaviruksen virionien valmisteessa. Tätä RNA-riippuvaista DNA-polymeraasia kutsutaan käänteiskopioijaksi tai revertaasiksi.

Lintujen retrovirusten revertaasi on tutkittu yksityiskohtaisimmin. Jokainen virioni sisältää noin 50 molekyyliä tätä entsyymiä. Käänteistranskriptaasi koostuu kahdesta alayksiköstä - a (65 kDa) ja b (95 kDa), joita on läsnä ekvimolaarisina määrinä. Käänteistranskriptaasilla on vähintään kolme entsymaattista aktiivisuutta:

1) DNA-polymeraasi käyttäen sekä RNA:ta että DNA:ta templaattina;

2) RNaasi H:n aktiivisuus, joka hydrolysoi RNA:ta osana RNA-DNA-hybridiä;

3) DNA-endonukleaasiaktiivisuus.

Kaksi ensimmäistä aktiivisuutta tarvitaan viruksen DNA-synteesiin, ja endonukleaasi näyttää olevan tärkeä virus-DNA:n integroitumiselle isäntäsolun genomiin. Puhdistettu käänteistranskriptaasi syntetisoi DNA:ta sekä RNA- että DNA-templaateilla (kuvio 11).

Riisi. 11. Kaavio RNA-molekyylien kaksijuosteisten DNA-kopioiden synteesiä varten

Synteesin aloittamiseksi reversetaasi, kuten muutkin polymeraasit, tarvitsee lyhyen kaksijuosteisen alueen (alukkeen). Aluke voi olla sekä RNA:n että DNA:n yksijuosteinen segmentti, joka reaktion aikana sitoutuu kovalenttisesti vasta syntetisoituun DNA-juosteeseen. Geenitekniikassa käytetään sekä mRNA:n 3'-polyA-päille komplementaarisia oligo-(dT)-alukkeita että koostumukseltaan ja sekvenssiltään "satunnaisia" heksanukleotidijoukkoja (satunnaisia ​​alukkeita). niillä ei ole 3'-poly(A)-päitä, käytä kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, jotka ovat komplementaarisia 3"-päälle

Käänteistranskriptaasia käytetään pääasiassa transkriptoimaan lähetti-RNA:ta komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA). Käänteistranskriptioreaktio suoritetaan erityisesti valituissa olosuhteissa käyttämällä voimakkaita RNaasi-aktiivisuuden estäjiä. Tässä tapauksessa on mahdollista saada täyspitkiä DNA-kopioita kohde-RNA-molekyyleistä. Komplementaarisen DNA-juosteen synteesin mRNA:lla ja RNA:n tuhoutumisen jälkeen (yleensä käytetään alkalikäsittelyä) syntetisoidaan toinen DNA-juoste. Tässä tapauksessa käytetään reversetaasin kykyä muodostaa itseään täydentäviä hiusneuloja yksijuosteisen cDNA:n 3'-päihin, jotka voivat toimia alukkeena.

Templaatti on cDNA:n ensimmäinen juoste. Tätä reaktiota voidaan katalysoida sekä reversetaasilla että E. colin DNA-polymeraasi I:llä. On osoitettu, että näiden kahden entsyymin yhdistelmä tekee mahdolliseksi lisätä täydellisten kaksijuosteisten cDNA-molekyylien saantoa. Synteesin päätyttyä cDNA:n ensimmäinen ja toinen juoste pysyvät kovalenttisesti kytkettyinä hiusneulasilmukalla, joka toimi alukkeena toisen juosteen synteesissä. Tämä silmukka katkaistaan ​​S1-endonukleaasilla, joka spesifisesti tuhoaa nukleiinihappojen yksijuosteisia alueita. Tuloksena olevat päät eivät aina ole tylsiä, ja myöhemmän kloonauksen tehokkuuden lisäämiseksi ne korjataan tylsiksi käyttämällä E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia. Tuloksena oleva kaksijuosteinen cDNA voidaan sitten insertoida kloonausvektoreihin, lisätä hybridi-DNA-molekyyleinä ja käyttää jatkotutkimukseen.

Revertaasi on entsyymi, joka syntetisoi cDNA:ta RNA-templaatissa.

Joissakin viruksissa genomi ei ole DNA, kuten tavallista, vaan RNA. Tällaisia ​​viruksia kutsuttiin retroviruksiksi (retro - käänteinen). Vuonna 1970 D. Baltimore ja H. M. Temin löysivät mekanismin tiedon siirtämiseksi viruksen RNA:sta DNA:han, ts. päinvastoin kuin soluissa tapahtuu korkeammat organismit. Tätä prosessia kutsutaan käänteistranskriptioksi, ja sen suorittavaa entsyymiä kutsutaan käänteiskopioijaksi tai revertaasiksi.

Käänteiskopioija tai revertaasi (käänteinen transkriptaasi, [lat. transkriptio- uudelleenkirjoitus) - RNA-riippuvainen DNA-polymeraasientsyymi, jonka avulla suoritetaan käänteiskopiointi - DNA-synteesi RNA-templaatilla; joidenkin RNA:ta sisältävien virusten genomit ja korkeampien organismien genomin liikkuvat geneettiset elementit koodaavat, mikä on tärkeä "työkalu" geenitekniikalle. Käänteistranskriptaasilla on vähintään kolme entsymaattista aktiivisuutta:

1) DNA-polymeraasi käyttäen sekä RNA:ta että DNA:ta templaattina;

2) RNaasi H:n aktiivisuus, joka hydrolysoi RNA:ta RNA-DNA-hybridissä, mutta ei yksi- tai kaksijuosteista RNA:ta, ja

3) DNA-endonukleaasiaktiivisuus.

D. Baltimore ja H. Temin löysivät sen itsenäisesti vuonna 1970 RNA:ta sisältävistä kasvainviruksista (Nobel-palkinto vuodelta 1975, yhdessä R. Dulbeccon kanssa).

Siten käänteistranskriptaasit pystyvät syntetisoimaan DNA:ta RNA-templaatissa polymeroimalla neljääa. Ja aivan kuten DNA-polymeraasit, ne toimivat vain siemenen läsnä ollessa.

Käänteistranskriptaaseja käytetään RNA:lle (erityisesti mRNA:lle) komplementaarisen kaksijuosteisen DNA:n synteesissä sen myöhempää kloonausta varten plasmidivektoreihin cDNA-kirjastojen (clonotecs) saamiseksi. Käänteistranskriptaaseja, kuten DNA-polymeraaseja, voidaan käyttää radioaktiivisen tai fluoresoivan leiman viemiseen DNA-koettimiin sopivasti leimatuissassa.

Kyky syntetisoida DNA:ta RNA-templaatista tietyissä olosuhteissa on osoitettu lämpöstabiililla Thermus thermophilus DNA -polymeraasilla. Tämä mahdollistaa sen käytön spesifisten RNA:iden suoraan havaitsemiseen biologisista näytteistä PCR:llä. Tämän lähestymistavan nykyaikaiset modifikaatiot mahdollistavat sen, että yhdessä reaktioseoksessa (ja koeputkessa) voidaan syntetisoida käänteistranskriptioreaktiossa pieni määrä kopioita monistetusta DNA-fragmentista RNA-templaatissa, joita sama entsyymi käyttää välittömästi templaattina. tavanomaisessa PCR:ssä (yksi putken PCR).