Reverzní transkriptáza (revertáza). Reverzní transkriptáza (revertáza) Jaký proces využívá enzym reverzní transkriptáza

Při studiu retrovirů, jejichž genom je reprezentován jednovláknovými molekulami RNA, bylo zjištěno, že v procesu intracelulárního vývoje procházejí fází integrace svého genomu ve formě dvouvláknové DNA do chromozomů hostitele. buňka. V roce 1964 předložil X. Temin hypotézu o existenci virově specifického enzymu schopného syntetizovat komplementární DNA na templátu RNA. V roce 1970 X. Temin a S. Mizutani, stejně jako nezávisle D. Baltimore, objevili takový enzym v preparátu extracelulárních virionů viru Rousova sarkomu. Tato RNA-dependentní DNA polymeráza se nazývá reverzní transkriptáza (reverzní transkriptáza).

Revertáza ptačích retrovirů byla studována nejpodrobněji. Každý virion obsahuje asi 50 molekul tohoto enzymu. Reverzní transkriptáza se skládá ze dvou podjednotek, ά (65 kDa) a β (95 kDa), přítomných v ekvimolárních množstvích. ά-podjednotka je N-koncová část (dvě třetiny) β-podjednotky.

Reverzní transkriptáza má alespoň tři enzymatické aktivity:

DNA polymeráza, využívající RNA i DNA jako templát;

aktivita RNázy H, která hydrolyzuje RNA v hybridu RNA-DNA, ale ne jednovláknovou nebo dvouvláknovou RNA;

DNA endonukleáza.

První dvě aktivity jsou nutné pro syntézu virové DNA a endonukleáza se zdá být důležitá pro integraci virové DNA do genomu hostitelské buňky. β-podjednotka reverzní má všechny tři aktivity, zatímco ά-podjednotka má pouze polymerázu a RNázu H.

Purifikovaná reverzní transkriptáza syntetizuje DNA na templátech RNA i DNA. K zahájení syntézy potřebuje reverzní táza, stejně jako ostatní polymerázy, krátkou dvouvláknovou oblast – primer. Primerem může být jednovláknový segment RNA i DNA, který se v průběhu reakce kovalentně naváže na nově syntetizovaný řetězec DNA.

Reverzní transkriptáza se používá převážně k přepisu messenger RNA do komplementární DNA (cDNA). Reverzní transkripční reakce se provádí v přítomnosti silných inhibitorů RNázové aktivity. V tomto případě je možné získat úplné kopie DNA cílových molekul RNA. Oligo(dT) se používá jako primer pro reverzní transkripci mRNA obsahující poly(A) (obr.) a pro molekuly RNA, které nemají 3" poly(A) konce, chemicky syntetizované oligonukleotidy komplementární k 3" konci studoval RNA. Kromě toho lze druhý typ molekul RNA převést na molekuly obsahující poly(A) pomocí poly(A) polymerázy E. coli.

Po syntéze na mRNA komplementárního řetězce DNA a destrukci RNA (obvykle se používá alkalické ošetření) je syntetizováno druhé vlákno DNA. V tomto případě se využívá schopnosti reverzní tázy vytvářet na 3" koncích jednovláknové cDNA samokomplementární vlásenky, které mohou fungovat jako primer. První vlákno cDNA slouží jako templát. Tato reakce může být katalyzována jak reverzní, tak E. coli DNA polymerázou I. Kombinace těchto dvou enzymů umožňuje zvýšit výtěžek plnohodnotných molekul dvouvláknové cDNA.

Po dokončení syntézy zůstávají první a druhé vlákno cDNA kovalentně spojeno vlásenkovou smyčkou, která sloužila jako primer při syntéze druhého vlákna. Tato smyčka je štěpena endonukleázou S1, která specificky ničí jednovláknové oblasti nukleových kyselin. Výsledné konce nejsou vždy tupé a pro zvýšení účinnosti následného klonování jsou opraveny na tupé pomocí Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerázy I. Výsledná dvouvláknová cDNA pak může být vložena do klonovacích vektorů, propagována jako hybridní molekuly DNA a použita pro další výzkum.

Reverzní transkriptáza (reverzní nebo RNA-dependentní DNA polymerázou) je enzym, který katalyzuje syntézu DNA na templátu RNA v procesu zvaném „ zpětný přepis". Název procesu odráží opak procesu přepisy provádí se v opačném směru: transkript RNA je syntetizován z molekuly templátu DNA.

Tyto enzymy byly izolovány z RNA virů ( retroviry). Reverzní transkriptázu využívají nádorové viry k přepisu mRNA do komplementárního řetězce DNA. Při studiu retrovirů, jejichž genom je reprezentován jednovláknovými molekulami RNA, bylo zjištěno, že v procesu intracelulárního vývoje retrovirus prochází fází integrace svého genomu ve formě dvouvláknové DNA do chromozomů hostitelská buňka. V roce 1964 Temin předložil hypotézu o existenci virově specifického enzymu schopného syntetizovat komplementární DNA na templátu RNA. Úsilí zaměřené na izolaci takového enzymu bylo korunováno úspěchem a v roce 1970 objevili Temin a Mizutani a nezávisle na nich i Baltimore požadovaný enzym v preparátu extracelulárních virionů viru Rousova sarkomu. Tato RNA-dependentní DNA polymeráza se nazývá reverzní transkriptáza nebo revertáza.

Revertáza ptačích retrovirů byla studována nejpodrobněji. Každý virion obsahuje asi 50 molekul tohoto enzymu. Reverzní transkriptáza se skládá ze dvou podjednotek - a (65 kDa) a b (95 kDa), přítomných v ekvimolárních množstvích. Reverzní transkriptáza má alespoň tři enzymatické aktivity:

1) DNA polymeráza s použitím RNA i DNA jako templátu;

2) aktivita RNázy H, která hydrolyzuje RNA jako součást hybridu RNA-DNA;

3) Aktivita DNA endonukleázy.

První dvě aktivity jsou nutné pro syntézu virové DNA a endonukleáza se zdá být důležitá pro integraci virové DNA do genomu hostitelské buňky. Purifikovaná reverzní transkriptáza syntetizuje DNA na templátech RNA i DNA (obr. 11).

Rýže. 11. Schéma syntézy kopií dvouvláknové DNA molekul RNA

K zahájení syntézy potřebuje reverzní táza, stejně jako jiné polymerázy, krátkou dvouvláknovou oblast (primer). Primerem může být jednovláknový segment RNA i DNA, který se v průběhu reakce kovalentně naváže na nově syntetizovaný řetězec DNA. V genetickém inženýrství se používají jak oligo-(dT) primery komplementární k 3'-polyA koncům mRNA, tak sada hexanukleotidů „náhodných“ ve složení a sekvenci (náhodné primery). Často pro molekuly RNA se známou primární sekvencí, která nemají 3'-poly (A) konce, použijte chemicky syntetizované oligonukleotidy komplementární k 3" konci

Reverzní transkriptáza se používá převážně k přepisu messenger RNA do komplementární DNA (cDNA). Reverzní transkripční reakce se provádí za speciálně vybraných podmínek za použití silných inhibitorů aktivity RNázy. V tomto případě je možné získat úplné kopie DNA cílových molekul RNA. Po syntéze na mRNA komplementárního řetězce DNA a destrukci RNA (obvykle se používá alkalické ošetření) je syntetizováno druhé vlákno DNA. V tomto případě je využita schopnost reverzní exprese tvořit samokomplementární vlásenky na 3' koncích jednovláknové cDNA, které mohou působit jako primer.

Templát je první vlákno cDNA. Tato reakce může být katalyzována jak reverzní, tak E. coli DNA polymerázou I. Ukázalo se, že kombinace těchto dvou enzymů umožňuje zvýšit výtěžek kompletních molekul dvouvláknové cDNA. Po dokončení syntézy zůstávají první a druhé vlákno cDNA kovalentně spojeno vlásenkovou smyčkou, která sloužila jako primer při syntéze druhého vlákna. Tato smyčka je štěpena endonukleázou S1, která specificky ničí jednovláknové oblasti nukleových kyselin. Výsledné konce nejsou vždy tupé a pro zvýšení účinnosti následného klonování jsou opraveny na tupé pomocí Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerázy I. Výsledná dvouvláknová cDNA pak může být vložena do klonovacích vektorů, propagována jako hybridní molekuly DNA a použita pro další výzkum.

Revertáza je enzym, který syntetizuje cDNA na templátu RNA.

U některých virů není genom DNA, jako obvykle, ale RNA. Takové viry se nazývaly retroviry (retro - reverzní). V roce 1970 D. Baltimore a H.M.Temin objevili mechanismus přenosu informace z virové RNA do DNA, tzn. opak toho, co se odehrává v buňkách vyšší organismy. Tento proces se nazývá reverzní transkripce a enzym, který jej provádí, se nazývá reverzní transkriptáza nebo revertáza.

Reverzní transkriptáza nebo revertáza (reverzní transkriptáza, [lat. transkripce- přepisování) - enzym RNA-dependentní DNA polymeráza, pomocí které se provádí reverzní transkripce - syntéza DNA na templátu RNA; kódován genomy některých virů obsahujících RNA a mobilními genetickými prvky genomu vyšších organismů, důležitým „nástrojem“ genetického inženýrství. Reverzní transkriptáza má alespoň tři enzymatické aktivity:

1) DNA polymeráza s použitím RNA i DNA jako templátu;

2) aktivita RNázy H, která hydrolyzuje RNA v hybridu RNA-DNA, ale ne jednovláknovou nebo dvouvláknovou RNA, a

3) Aktivita DNA endonukleázy.

Objeven nezávisle D. Baltimorem a H. Teminem v roce 1970 v nádorových virech obsahujících RNA (Nobelova cena za rok 1975 spolu s R. Dulbeccem).

Reverzní transkriptázy jsou tedy schopné syntetizovat DNA na templátu RNA polymerací čtyř deoxyribonukleosidtrifosfátů. A stejně jako DNA polymerázy fungují pouze v přítomnosti semene.

Reverzní transkriptázy se používají při syntéze dvouvláknové DNA komplementární k RNA (zejména mRNA) pro její následné klonování do plazmidových vektorů za účelem získání knihoven cDNA (klonotek). Reverzní transkriptázy, jako jsou DNA polymerázy, mohou být použity k zavedení radioaktivní nebo fluorescenční značky do DNA sond ve vhodně značených deoxyribonukleosid trifosfátech.

Schopnost syntetizovat DNA z templátu RNA za určitých podmínek byla prokázána u termostabilní DNA polymerázy Thermus thermophilus. To umožňuje jeho použití pro přímou detekci specifických RNA v biologických vzorcích pomocí PCR. Moderní modifikace tohoto přístupu umožňují v jedné reakční směsi (a zkumavce) syntetizovat v reakci reverzní transkripce malý počet kopií amplifikovaného fragmentu DNA na templátu RNA, které jsou okamžitě použity stejným enzymem jako templát v konvenční PCR (jedna zkumavka PCR).