Обратна транскриптаза (ревертаза). Обратна транскриптаза (ревертаза) Какъв процес използва ензима обратна транскриптаза
При изследване на ретровируси, чийто геном е представен от едноверижни РНК молекули, беше установено, че в процеса на вътреклетъчно развитие те преминават през етапа на интегриране на техния геном под формата на двуверижна ДНК в хромозомите на гостоприемника клетка. През 1964 г. X. Temin излага хипотеза за съществуването на вирус-специфичен ензим, способен да синтезира комплементарна ДНК върху РНК шаблон. През 1970 г. X. Temin и S. Mizutani, както и независимо D. Baltimore, откриват такъв ензим в препарат от вириони на извънклетъчния вирус на саркома на Rous. Тази РНК-зависима ДНК полимераза се нарича обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).
Ревертазата на птичи ретровируси е проучена най-подробно. Всеки вирион съдържа около 50 молекули от този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици, ά (65 kDa) и β (95 kDa), присъстващи в еквимоларни количества. ά-субединицата е N-терминалната част (две трети) на β-субединицата.
Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
ДНК полимераза, като се използва както РНК, така и ДНК като матрица;
активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК в хибрида РНК-ДНК, но не едноверижна или двуверижна РНК;
ДНК ендонуклеаза.
Първите две дейности са необходими за синтеза на вирусна ДНК, а ендонуклеазата изглежда е важна за интегрирането на вирусната ДНК в генома на клетката гостоприемник. β-субединицата на реверстазата има и трите дейности, докато ά-субединицата има само полимераза и РНКаза Н.
Пречистената обратна транскриптаза синтезира ДНК върху РНК и ДНК шаблони. За да започне синтеза, реверстазата, подобно на другите полимерази, се нуждае от къса двуверижна област - праймер. Праймерът може да бъде едноверижен сегмент както от РНК, така и от ДНК, които в хода на реакцията се свързват ковалентно с новосинтезираната ДНК верига.
Обратната транскриптаза се използва предимно за транскрибиране на информационна РНК в комплементарна ДНК (кДНК). Реакцията на обратна транскрипция се извършва в присъствието на силни инхибитори на РНКазната активност. В този случай е възможно да се получат ДНК копия с пълна дължина на целевите РНК молекули. Oligo(dT) се използва като праймер за обратна транскрипция на поли(А)-съдържаща иРНК (фиг.), а за молекули на РНК, които нямат 3" поли(А) краища, химически синтезирани олигонуклеотиди, комплементарни на 3" края изследвана РНК. В допълнение, последният тип РНК молекули могат да бъдат превърнати в поли(А)-съдържащи такива с помощта на E.coli поли(А) полимераза.
След синтез върху тРНК на комплементарната ДНК верига и разрушаване на РНК (обикновено се използва алкално третиране), се синтезира втората верига на ДНК. В този случай се използва способността на реверсетазата да образува самокомплементарни фиби в 3 "края на едноверижна сДНК, която може да действа като праймер. Първата верига на сДНК служи като матрица. Тази реакция може да бъде катализирана както от реверстаза, така и от ДНК полимераза I на E. coli. Комбинацията от тези два ензима позволява да се увеличи добива на пълноценни двуверижни сДНК молекули.
След завършване на синтеза, първата и втората нишки на сДНК остават ковалентно свързани с бримка с фиби, която служи като праймер при синтеза на втората верига. Тази бримка се разцепва с S1 ендонуклеаза, която специфично разрушава едноверижни области на нуклеинови киселини. Получените краища не винаги са тъпи и за да се увеличи ефективността на последващото клониране, те се възстановяват до тъпи с помощта на фрагмента на Klenow на ДНК полимераза I на E. coli. Получената двойно-верижна сДНК може след това да се вмъкне в клониращи вектори, да се размножи като хибридни ДНК молекули и да се използва за по-нататъшни изследвания.
Обратна транскриптаза (реверстаза или РНК-зависима ДНК полимераза) е ензим, който катализира синтеза на ДНК върху РНК шаблон в процес, наречен „ обратна транскрипция”. Името на процеса отразява обратното на процеса транскрипцииизвършва се в другата посока: от ДНК матрица се синтезира транскрипт на РНК.
Тези ензими са изолирани от РНК вируси ( ретровируси). Обратната транскриптаза се използва от туморни вируси за транскрибиране на иРНК в комплементарна верига на ДНК. При изследване на ретровируси, чийто геном е представен от едноверижни РНК молекули, беше установено, че в процеса на вътреклетъчно развитие ретровирусът преминава през етапа на интегриране на своя геном под формата на двуверижна ДНК в хромозомите на клетката гостоприемник. През 1964 г. Темин излага хипотеза за съществуването на вирус-специфичен ензим, способен да синтезира комплементарна ДНК върху РНК шаблон. Усилията, насочени към изолирането на такъв ензим, се увенчават с успех и през 1970 г. Темин и Мизутани, както и Балтимор независимо от тях, откриват желания ензим в препарат от вириони на извънклетъчния сарком на Роус. Тази РНК-зависима ДНК полимераза се нарича обратна транскриптаза или ревертаза.
Ревертазата на птичи ретровируси е проучена най-подробно. Всеки вирион съдържа около 50 молекули от този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици - a (65 kDa) и b (95 kDa), присъстващи в еквимоларни количества. Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
1) ДНК полимераза, като се използва както РНК, така и ДНК като матрица;
2) активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК като част от РНК-ДНК хибрид;
3) ДНК ендонуклеазна активност.
Първите две дейности са необходими за синтеза на вирусна ДНК, а ендонуклеазата изглежда е важна за интегрирането на вирусната ДНК в генома на клетката гостоприемник. Пречистената обратна транскриптаза синтезира ДНК върху РНК и ДНК шаблони (фиг. 11).
Ориз. 11. Схема за синтез на двуверижни ДНК копия на РНК молекули
За да започне синтеза, реверстазата, подобно на други полимерази, се нуждае от къса двуверижна област (праймер). Праймерът може да бъде едноверижен сегмент както от РНК, така и от ДНК, които в хода на реакцията се свързват ковалентно с новосинтезираната ДНК верига. В генното инженерство се използват както олиго-(dT) праймери, комплементарни на 3'-polyA краищата на иРНК, така и набор от хексануклеотиди, „случайни“ по състав и последователност (случайни праймери). Често за РНК молекули с известна първична последователност, която нямат 3'-поли (А) краища, използвайте химически синтезирани олигонуклеотиди, комплементарни на 3" края
Обратната транскриптаза се използва предимно за транскрибиране на информационна РНК в комплементарна ДНК (кДНК). Реакцията на обратна транскрипция се провежда при специално подбрани условия, като се използват силни инхибитори на РНКазната активност. В този случай е възможно да се получат ДНК копия с пълна дължина на целевите РНК молекули. След синтез върху тРНК на комплементарната ДНК верига и разрушаване на РНК (обикновено се използва алкално третиране), се синтезира втората верига на ДНК. В този случай се използва способността на реверстазата да образува самокомплементарни фиби в 3' краищата на едноверижна сДНК, която може да действа като праймер.
Шаблонът е първата верига на сДНК. Тази реакция може да бъде катализирана както от реверстаза, така и от ДНК полимераза I на E. coli. Доказано е, че комбинацията от тези два ензима прави възможно увеличаването на добива на пълни двойноверижни сДНК молекули. След завършване на синтеза, първата и втората нишки на сДНК остават ковалентно свързани с бримка с фиби, която служи като праймер при синтеза на втората верига. Тази бримка се разцепва с S1 ендонуклеаза, която специфично разрушава едноверижни области на нуклеинови киселини. Получените краища не винаги са тъпи и за да се увеличи ефективността на последващото клониране, те се възстановяват до тъпи с помощта на фрагмента на Klenow на ДНК полимераза I на E. coli. Получената двойно-верижна сДНК може след това да се вмъкне в клониращи вектори, да се размножи като хибридни ДНК молекули и да се използва за по-нататъшни изследвания.
Ревертазата е ензим, който синтезира сДНК върху РНК шаблон.
При някои вируси геномът не е ДНК, както обикновено, а РНК. Такива вируси се наричаха ретровируси (ретро - обратно). През 1970 г. Д. Балтимор и Х. М. Темин откриват механизъм за пренос на информация от вирусна РНК към ДНК, т.е. обратното на това, което се случва в клетките висши организми. Този процес се нарича обратна транскрипция, а ензимът, който го осъществява, се нарича обратна транскриптаза или ревертаза.
Обратна транскриптаза, или ревертаза (обратна транскриптаза, [лат. транскрипция- пренаписване) - ензимът РНК-зависима ДНК полимераза, с помощта на който се извършва обратна транскрипция - синтез на ДНК върху РНК шаблон; кодирани от геномите на някои РНК-съдържащи вируси и мобилни генетични елементи на генома на висши организми, важен „инструмент“ за генното инженерство. Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
1) ДНК полимераза, като се използва както РНК, така и ДНК като матрица;
2) активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК в хибрида РНК-ДНК, но не едно- или двуверижна РНК, и
3) ДНК ендонуклеазна активност.
Открит независимо от Д. Балтимор и Х. Темин през 1970 г. в РНК-съдържащи туморни вируси (Нобелова награда за 1975 г., заедно с Р. Дълбеко).
По този начин, обратните транскриптази са способни да синтезират ДНК върху РНК шаблон чрез полимеризация на четири дезоксирибонуклеозидни трифосфати. И точно като ДНК полимеразите, те функционират само в присъствието на семе.
Обратните транскриптази се използват при синтеза на двойноверижна ДНК, комплементарна на РНК (особено иРНК) за последващото й клониране в плазмидни вектори за получаване на библиотеки на кДНК (клонотек). Обратните транскриптази, като ДНК полимерази, могат да се използват за въвеждане на радиоактивен или флуоресцентен етикет в ДНК сонди в подходящо белязани дезоксирибонуклеозидни трифосфати.
Способността да се синтезира ДНК от РНК шаблон при определени условия е доказана за термостабилната Thermus thermophilus ДНК полимераза. Това позволява да се използва за директно откриване на специфични РНК в биологични проби чрез PCR. Съвременните модификации на този подход позволяват в една реакционна смес (и епруветка) да се синтезират в реакцията на обратна транскрипция малък брой копия на амплифицирания ДНК фрагмент върху РНК шаблон, които незабавно се използват от същия ензим като шаблон при конвенционален PCR (PCR с една епруветка).