Зворотня транскриптаза (ревертаза). Зворотня транскриптаза (ревертаза) У якому процесі використовується фермент зворотна транскриптаза

При вивченні ретровірусів, геном яких представлений молекулами одноланцюгової РНК, було виявлено, що в процесі внутрішньоклітинного розвитку вони проходять стадію інтеграції свого геному у вигляді дволанцюжкової ДНК до хромосом клітини-господаря. У 1964 р. X. Темін висунув гіпотезу про існування вірусспецифічного ферменту, здатного синтезувати на РНК-матриці комплементарну ДНК. У 1970 р. X. Темін і С. Мізутані, а також незалежно від них Д. Балтімор відкрили такий фермент у препараті позаклітинних віріонів вірусу саркоми Рауса. Ця РНК-залежна ДНК-полімераза отримала назву ревертаза (зворотна транскриптаза).

Найбільш детально вивчено ревертазу ретровірусів птахів. Кожен віріон містить близько 50 молекул цього ферменту. Зворотна транскриптаза складається з двох субодиниць – ά (65 кДа) та β (95 кДа), присутніх в еквімолярній кількості. ά -Субодиниця являє собою N-кінцеву частину (дві третини) β-субодиниці.

Зворотна транскриптаза має принаймні три ферментативні активності:

· ДНК-полімеразної, що використовує як матрицю як РНК, так і ДНК;

· активністю РНКази Н, гідролізуючої РНК у складі гібриду РНК-ДНК, але не одно-або дволанцюжкову РНК;

· ДНК-ендонуклеазний.

Перші дві активності необхідні синтезу вірусної ДНК, а эндонуклеаза, очевидно, важлива для інтеграції вірусної ДНК в геном клітини-господаря. β-субодиниця ревертази має всі три активності, у той час як ά-субодиниця - тільки полімеразна і РНКази Н.

Очищена зворотна транскриптаза синтезує ДНК як на РНК, так і на ДНК-матрицях. Щоб розпочати синтез, ревертазі, як і іншим полімеразам, необхідна коротка дволанцюжкова ділянка - праймер. Праймером може бути одноланцюговий сегмент як РНК, і ДНК, які у процесі реакції виявляються ковалентно пов'язаними з новосинтезованим ланцюгом ДНК.

Зворотну транскриптазу переважно використовують для транскрипції матричної РНК у комплементарну ДНК (кДНК). Реакцію зворотної транскрипції проводять у присутності сильних інгібіторів РНКазної активності. При цьому вдається отримати повнорозмірні ДНК-копії цільових молекул РНК. Як праймер при зворотній транскрипції полі (А)-містять мРНК використовують оліго(dT) (рис.), а для молекул РНК, що не мають 3"-полі (А)-кінців, - хімічно синтезовані олігонуклеонди, комплементарні 3"-кінцю вивчається РНК. Крім того, останній тип молекул РНК можна перевести в полі(А)-містять за допомогою полі(А)-полімерази Е. coli.

Після синтезу на мРНК комплементарного ланцюга ДНК та руйнування РНК (зазвичай застосовують обробку лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. При цьому використовують здатність ревертази утворювати на 3"-кінцях одноланцюгових кДНК самокомплементарні шпильки, які можуть виконувати функції праймера. Матрицею служить перший ланцюг кДНК. Дана реакція може каталізуватися як ревертазою, так і ДНК-полімеразою I E. coli. Поєднання цих двох ферментів підвищити вихід повноцінних дволанцюгових молекул кДНК

Після закінчення синтезу перший і другий ланцюги кДНК залишаються ковалентно пов'язаними петлею шпильки, що служила праймером при синтезі другого ланцюга. Цю петлю розщеплюють ендонуклеазою S1, що специфічно руйнує одноланцюгові ділянки нуклеїнових кислот. кінці, що утворюються при цьому, не завжди виявляються тупими, і для підвищення ефективності подальшого клонування їх репарують до тупих за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази I E. coli. Отриману дволанцюжкову кДНК можна потім вбудовувати в вектори, що клонують, розмножувати у складі гібридних молекул ДНК і використовувати для подальших досліджень.

Зворотня транскриптаза (ревертаза або РНК-залежна ДНК-полімераза) являє собою фермент, що каталізує синтез ДНК на матриці РНК у процесі, який отримав назву “ зворотна транскрипція”. Назва процесу відображає протилежність процесу транскрипції, що здійснюється в іншому напрямку: з молекули ДНК-матриці синтезується РНК-транскрипт

Ці ферменти були виділені з РНК-вірусів ( ретровірусів). Зворотна транскриптаза використовується пухлинними вірусами для транскрипції м-РНК у комплементарний ланцюг ДНК. При вивченні ретровірусів, геном яких представлений молекулами одноланцюгової РНК, було виявлено, що в процесі внутрішньоклітинного розвитку ретровірус проходить стадію інтеграції свого геному у вигляді дволанцюгової ДНК у хромосоми клітини-хазяїна. У 1964 р. Темін висунув гіпотезу про існування вірусспецифічного ферменту, здатного синтезувати на РНК-матриці комплементарну ДНК. Зусилля, спрямовані на виділення такого ферменту, увінчалися успіхом, і в 1970 р. Темін з Мізутані, а також незалежно від них Балтімор відкрили шуканий фермент у препараті позаклітинних віріонів вірусу саркоми Рауса. Ця РНК-залежна ДНК-полімераза отримала назву зворотна транскриптаза, або ревертаза.

Найбільш детально вивчено ревертазу ретровірусів птахів. Кожен віріон містить близько 50 молекул цього ферменту. Зворотна транскриптаза складається з двох субодиниць - a (65 кДа) та b (95 кДа), присутніх в еквімолярній кількості. Зворотна транскриптаза має принаймні три ферментативні активності:

1) ДНК-полімеразної, що використовує як матрицю як РНК, так і ДНК;

2) активністю РНКази Н, що гідролізує РНК у складі гібриду РНК – ДНК;

3) ДНК-ендонуклеазною активністю.

Перші дві активності необхідні синтезу вірусної ДНК, а эндонуклеаза, очевидно, важлива для інтеграції вірусної ДНК в геном клітини-господаря. Очищена зворотна транскриптаза синтезує ДНК як на РНК, так і на ДНК-матрицях (рис. 11).

Рис. 11. Схема синтезу дволанцюгових ДНК-копій молекул РНК

Щоб розпочати синтез, ревертазі, як і іншим полімеразам, необхідна коротка дволанцюжкова ділянка (праймер). Праймером може бути одноланцюговий сегмент як РНК, і ДНК, які у процесі реакції виявляються ковалентно пов'язаними з новосинтезованим ланцюгом ДНК. У генетичній інженерії використовують як оліго-(дТ) праймери, комплементарні 3"-поліА кінцям мРНК, так і набір "випадкових" за складом та послідовністю гексануклеотидів (random primers). Часто для молекул РНК з відомою первинною послідовністю, що не мають З"- полі (А) кінців, використовують хімічно синтезовані олігонуклеотиди, комплементарні З"-кінцю

Зворотну транскриптазу переважно використовують для транскрипції матричної РНК у комплементарну ДНК (кДНК). Реакцію зворотної транскрипції проводять у спеціально підібраних умовах із використанням сильних інгібіторів РНКазної активності. При цьому вдається отримати повнорозмірні ДНК-копії цільових молекул РНК. Після синтезу на мРНК комплементарного ланцюга ДНК та руйнування РНК (зазвичай застосовують обробку лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. При цьому використовують здатність ревертази утворювати на 3"-кінцях одноланцюгових кДНК самокомплементарні шпильки, які можуть виконувати функції праймера.

Матрицею служить перший ланцюг кДНК. Ця реакція може каталізуватися як ревертазою, так і ДНК-полімеразою I E. coli. Показано, що поєднання цих двох ферментів дозволяє підвищити вихід повноцінних дволанцюгових молекул кДНК. Після закінчення синтезу перший і другий ланцюги кДНК залишаються ковалентно пов'язаними петлею шпильки, що служила праймером при синтезі другого ланцюга. Цю петлю розщеплюють ендонуклеазою S1, що специфічно руйнує одноланцюгові ділянки нуклеїнових кислот. кінці, що утворюються при цьому, не завжди виявляються тупими, і для підвищення ефективності подальшого клонування їх репарують до тупих за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази I E. coli. Отриману дволанцюжкову кДНК можна потім вбудовувати в вектори, що клонують, розмножувати у складі гібридних молекул ДНК і використовувати для подальших досліджень.

Ревертаза – фермент, що синтезує кДНК на матриці РНК.

У деяких вірусів геномом служить не ДНК, як завжди, а РНК. Такі віруси були названі ретровірусами (ретро – зворотний). У 1970 р. Д.Балтімор і Х.М.Темін відкрили механізм передачі від вірусної РНК до ДНК, тобто. навпаки тому, що має місце у клітинах вищих організмів. Такий процес отримав назву зворотної транскрипції, а фермент, що його здійснює, був названий зворотною транскриптазою або ревертазою (revertase).

Зворотна транскриптаза або ревертаза (reverse transcriptase, [лат. transcriptio- переписування) – фермент РНК-залежна ДНК-полімераза, за допомогою якого здійснюється зворотна транскрипція – синтез ДНК на матриці РНК; кодується геномами деяких РНК-вірусів і рухливих генетичних елементів геному вищих організмів, важливий «інструмент» для генної інженерії. Зворотна транскриптаза має принаймні три ферментативні активності:

1) ДНК-полімеразної, що використовує як матрицю як РНК, так і ДНК;

2) активністю РНКази Н, гідролізуючої РНК у складі гібриду РНК-ДНК, але не одно-або дволанцюжкову РНК та

3) ДНК-ендонуклеазною активністю.

Відкрита незалежно один від одного Д. Балтімором і Х. Теміним в 1970 р. в РНК-пухлинних вірусах (Нобелевская премія за 1975 р. спільно з Р. Дульбекко).

Отже, зворотні транскриптази здатні здійснювати синтез ДНК на матриці РНК, полімеризуючи чотири дезоксирибонуклеозидтрифосфат. І так само, як і ДНК-полімерази, функціонують лише за наявності затравки.

Зворотні транскриптази застосовуються у синтезі дволанцюгових ДНК, комплементарних РНК (особливо мРНК), для подальшого її клонування в плазмідних векторах при отриманні бібліотек (клонотек) кДНК. Зворотні транскриптази, подібно до ДНК-полімераз, можуть бути використані для введення радіоактивної або флуоресцентної мітки в ДНК-зонди у складі відповідним чином мічених дезоксирибонуклеозидтрифосфатів.

Здатність синтезувати ДНК на матриці РНК у певних умовах була продемонстрована для термостабільної ДНК-полімерази Thermus thermophilus. Це дозволяє використовувати її для прямого виявлення специфічних РНК у біологічних зразках методом ПЛР. Сучасні модифікації такого підходу дають можливість в одній реакційній суміші (і пробірці) синтезувати в реакції зворотної транскрипції невелике число копій фрагмента ДНК, що ампліфікується, на матриці РНК, які відразу ж використовуються тим же ферментом як матриця в звичайній ПЛР (one tube PCR).