Життя будь-якого організму можливе завдяки процесам обміну речовин, що протікають у ньому. Цими реакціями керують природні каталізатори або ферменти. Інша назва цих речовин – ензими. Термін "ферменти" походить від латинського fermentum, що означає "закваска". Поняття виникло історично щодо процесів бродіння.

Рис. 1 - Бродіння з використанням дріжджів - типовий приклад ферментативної реакції

Людство давно користується корисними властивостями цих ферментів. Наприклад, вже багато століть із молока за допомогою сичужного ферменту роблять сир.

Ферменти відрізняються від каталізаторів тим, що діють у живому організмі, тоді як каталізатори – у неживій природі. Галузь біохімії, що вивчає ці найважливіші для життя речовини, називається ензимологією.

Загальні властивості ферментів

Ферменти є молекули білкової природи, які взаємодіють із різними речовинами, прискорюючи їх хімічне перетворення певним шляхом. При цьому вони не витрачаються. У кожному ферменті є активний центр, що приєднується до субстрату, та каталітичний ділянку, що запускає ту чи іншу хімічну реакцію. Ці речовини прискорюють біохімічні реакції, що протікають в організмі, без підвищення температури.

Основні властивості ферментів:

• специфічність: здатність ферменту діяти лише на специфічний субстрат, наприклад, ліпази – на жири;
• каталітична ефективність: здатність ферментативних білків прискорювати біологічні реакції у сотні та тисячі разів;
• здатність до регуляції: у кожній клітині вироблення та активність ферментів визначається своєрідним ланцюгом перетворень, що впливає на здатність цих білків знову синтезуватися.

Роль ферментів у людини неможливо переоцінити. У той час, коли ще відкрили структуру ДНК, говорили, що один ген відповідає за синтез одного білка, який уже визначає якусь певну ознаку. Зараз це твердження звучить так: «Один ген – один фермент – одна ознака». Тобто без активності ферментів у клітині життя не може існувати.

Класифікація

Залежно від участі у хімічних реакціях, розрізняються такі класи ферментів:

У живому організмі всі ферменти поділяються на внутрішньо-і позаклітинні. До внутрішньоклітинних відносяться, наприклад, ферменти печінки, що беруть участь у реакціях знешкодження різних речовин, що надходять із кров'ю. Вони виявляються у крові при пошкодженні органу, що допомагає у діагностиці його захворювань.

Внутрішньоклітинні ферменти, які є маркерами ушкодження внутрішніх органів:

• печінка - аланінамінотрансефраза, аспартатамінотрансфераза, гамма-глютамілтранспептидаза, сорбітдегідрогеназа;
• нирки – лужна фосфатаза;
• передміхурова залоза – кисла фосфатаза;
• серцевий м'яз - лактатдегідрогеназа

Позаклітинні ферменти виділяються залозами у зовнішнє середовище. Основні з них секретуються клітинами слинних залоз, шлункової стінки, підшлункової залози, кишечника і беруть активну участь у травленні.

Травні ферменти

Травні ферменти - це білки, які прискорюють розщеплення великих молекул, що входять до складу їжі. Вони поділяють такі молекули більш дрібні фрагменти, які легше засвоюються клітинами. Основні типи травних ферментів – протеази, ліпази, амілази.

Основна травна залоза – підшлункова. Вона виробляє більшість цих ферментів, і навіть нуклеаз, що розщеплюють ДНК і РНК, і пептидаз, що у освіті вільних амінокислот. Причому незначна кількість ферментів, що утворюються, здатна «обробити» великий обсяг їжі.

При ферментативному розщепленні поживних речовин виділяється енергія, яка витрачається на процеси обміну речовин та життєдіяльності. Без участі ферментів подібні процеси відбувалися б надто повільно, не забезпечуючи організм достатнім енергетичним запасом.

Крім того, участь ферментів у процесі травлення забезпечує розпад поживних речовин до молекул, здатних проходити через клітини кишкової стінки та надходити в кров.

Амілаза

Амілаза виробляється слинними залозами. Вона діє на крохмаль їжі, що складається з довгого ланцюга молекул глюкози. Внаслідок дії цього ферменту утворюються ділянки, що складаються з двох сполучених молекул глюкози, тобто фруктоза, та інші коротколанцюгові вуглеводи. Надалі вони метаболізуються до глюкози в кишечнику та звідти всмоктуються у кров.

Слинні залози розщеплюють лише частину крохмалю. Амілаза слини активна протягом короткого часу, доки їжа прожовується. Після потрапляння до шлунка фермент інактивується його кислим вмістом. Більшість крохмалю розщеплюється вже в 12-палої кишці під впливом панкреатичної амілази, що виробляється підшлунковою залозою.

Рис. 2 - Амілаза починає розщеплення крохмалю

Короткі вуглеводи, що утворилися під дією панкреатичної амілази, потрапляють до тонкого кишечника. Тут з допомогою мальтази, лактази, сахарази, декстринази вони розщеплюються молекул глюкози. Клітковина, що не розщеплюється ферментами, виводиться з кишечника з каловими масами.

Протеази

Білки чи протеїни – істотна частина людського раціону. Для їх розщеплення потрібні ферменти - протеази. Вони різняться за місцем синтезу, субстратам та іншим параметрам. Деякі їх активні в шлунку, наприклад, пепсин. Інші виробляються підшлунковою залозою та активні у просвіті кишечника. У самій залозі виділяється неактивний попередник ферменту – хімотрипсиноген, який починає діяти лише після змішування з кислим харчовим вмістом, перетворюючись на хімотрипсин. Такий механізм допомагає уникнути самоушкодження протеазами клітин підшлункової залози.

Рис. 3 - Ферментативне розщеплення білків

Протеази розщеплюють харчові білки більш дрібні фрагменти - полипептиды. Ферменти – пептидази руйнують їх до амінокислот, які засвоюються у кишечнику.

Ліпази

Харчові жири руйнуються ферментами-ліпазами, які також виробляються підшлунковою залозою. Вони розщеплюють молекули жиру на жирні кислоти та гліцерин. Така реакція вимагає наявності у просвіті 12-палої кишки жовчі, що утворюється у печінці.

Рис. 4 - Ферментативний гідроліз жирів

Роль замісної терапії препаратом "Мікразім"

Для багатьох людей з порушенням травлення, насамперед із захворюваннями підшлункової залози, призначення ферментів забезпечує функціональну підтримку органу та прискорює процеси одужання. Після усунення нападу панкреатиту або іншої гострої ситуації прийом ферментів можна припинити, оскільки організм самостійно відновлює їхню секрецію.

Тривалий прийом ферментативних препаратів необхідний лише при тяжкій зовнішньосекреторній недостатності підшлункової залози.

Одним із найбільш фізіологічних за своїм складом є препарат «Мікразім». До його складу входять амілаза, протеази та ліпаза, що містяться в панкреатичному соку. Тому не потрібно окремо підбирати, який фермент потрібно використовувати при різноманітних хворобах цього органу.

Показання для використання цих ліків:

• хронічний панкреатит, муковісцидоз та інші причини недостатньої секреції ферментів підшлункової залози;
• запальні захворювання печінки, шлунка, кишечника, особливо після операцій на них, для швидшого відновлення травної системи;
• похибки у харчуванні;
• порушення функції жування, наприклад при стоматологічних захворюваннях або малорухливості пацієнта.

Прийом травних ферментів із замісною метою допомагає уникнути здуття живота, рідкого випорожнення, болю в животі. Крім того, при тяжких хронічних захворюваннях підшлункової залози Мікразим повністю бере на себе функцію розщеплення поживних речовин. Тому можуть безперешкодно засвоюватися в кишечнику. Це особливо важливо для дітей, які страждають на муковісцидоз.

Важливо: перед застосуванням ознайомтеся з інструкцією або проконсультуйтеся з лікарем.

ФЕРМЕНТИ
органічні речовини білкової природи, які синтезуються в клітинах і в багато разів прискорюють реакції, що протікають в них, не піддаючись при цьому хімічним перетворенням. Речовини, що мають подібну дію, існують і в неживій природі і називаються каталізаторами. Ферменти (від латів. fermentum - бродіння, закваска) іноді називають ензимами (від грец. en - усередині, zyme - закваска). Усі живі клітини містять дуже великий набір ферментів, від каталітичної активності яких залежить функціонування клітин. Практично кожна з багатьох різноманітних реакцій, що протікають у клітині, вимагає участі специфічного ферменту. Вивченням хімічних властивостей ферментів та каталізованих ними реакцій займається особлива, дуже важлива область біохімії – ензимологія. Багато ферментів знаходяться в клітині у вільному стані, будучи просто розчинені в цитоплазмі; інші пов'язані із складними високоорганізованими структурами. Є й ферменти, які в нормі знаходяться поза клітиною; так, ферменти, що каталізують розщеплення крохмалю та білків, секретуються підшлунковою залозою в кишечник. Секретують ферменти та багато мікроорганізмів. Перші дані про ферменти були отримані щодо процесів бродіння і травлення. Великий внесок у дослідження бродіння зробив Л. Пастер, однак він вважав, що відповідні реакції можуть здійснювати тільки живі клітини. На початку 20 ст. Е. Бухнер показав, що зброджування сахарози з утворенням діоксиду вуглецю та етилового спирту може каталізуватися безклітинним дріжджовим екстрактом. Це важливе відкриття послужило стимулом до виділення та вивчення клітинних ферментів. У 1926 Дж. Самнер із Корнеллського університету (США) виділив уреазу; це був перший фермент, отриманий практично чистому вигляді. З того часу виявлено та виділено понад 700 ферментів, але в живих організмах їх існує набагато більше. Ідентифікація, виділення та вивчення властивостей окремих ферментів займають центральне місце у сучасній ензимології. Ферменти, що беруть участь у фундаментальних процесах перетворення енергії, таких, як розщеплення цукрів, освіта та гідроліз високоенергетичної сполуки аденозинтрифосфату (АТФ), присутні у клітинах усіх типів - тварин, рослинних, бактеріальних. Проте є ферменти, які утворюються лише у тканинах певних організмів. Так, ферменти, що у синтезі целюлози, виявляються у рослинних, але з тварин клітинах. Таким чином, важливо розрізняти "універсальні" ферменти та ферменти, специфічні для тих чи інших типів клітин. Взагалі, чим більше клітина спеціалізована, тим більша ймовірність, що вона синтезуватиме набір ферментів, необхідний для виконання конкретної клітинної функції.
Ферменти, як білки.Всі ферменти є білками, простими або складними (тобто містять поряд з білковим компонентом небілкову частину).
також БІЛКИ . Ферменти - великі молекули, їх молекулярні маси лежать у діапазоні від 10 000 до 1000 000 дальтон (Так). Для порівняння вкажемо мовляв. маси відомих речовин: глюкоза – 180, діоксид вуглецю – 44, амінокислоти – від 75 до 204 Так. Ферменти, що каталізують однакові хімічні реакції, але виділені з клітин різних типів, розрізняються за властивостями і складом, проте зазвичай мають певну схожість структури. Структурні особливості ферментів, необхідних їх функціонування, легко втрачаються. Так, при нагріванні відбувається перебудова білкового ланцюга, що супроводжується втратою каталітичної активності. Важливими є також лужні або кислотні властивості розчину. Більшість ферментів найкраще "працюють" у розчинах, pH яких близький до 7, коли концентрація іонів H+ та OH- приблизно однакова. Пов'язано це про те, що структура білкових молекул, отже, і активність ферментів сильно залежить від концентрації іонів водню серед. Не всі білки, присутні у живих організмах, є ферментами. Так, іншу функцію виконують структурні білки, багато специфічних білків крові, білкові гормони і т.д.
Коферменти та субстрати.Багато ферментів з великою молекулярною масою проявляють каталітичну активність лише у присутності специфічних низькомолекулярних речовин, які називають коферментами (або кофакторами). Роль коферментів грають більшість вітамінів та багато мінеральних речовин; саме тому вони повинні надходити в організм із їжею. Вітаміни РР (нікотинова кислота, або ніацин) та рибофлавін, наприклад, входять до складу коферментів, необхідних для функціонування дегідрогеназу. Цинк - кофермент карбоангідрази, ферменту, що каталізує вивільнення з крові діоксиду вуглецю, який видаляється з організму разом з повітрям, що видихається. Залізо і мідь є компонентами дихального ферменту цитохромоксидази. Речовина, що піддається перетворенню у присутності ферменту, називають субстратом. Субстрат приєднується до ферменту, який прискорює розрив одних хімічних зв'язків у його молекулі та створення інших; продукт, що утворюється в результаті, від'єднується від ферменту. Цей процес представляють так:

Продукт теж можна вважати субстратом, оскільки всі ферментативні реакції тією чи іншою мірою оборотні. Правда, зазвичай рівновага зрушена у бік утворення продукту, і зворотну реакцію важко зафіксувати.
Механізм впливу ферментів.Швидкість ферментативної реакції залежить від концентрації субстрату [[S]] та кількості наявного ферменту. Ці величини визначають, скільки молекул ферменту з'єднається з субстратом, і саме від вмісту фермент-субстратного комплексу залежить швидкість реакції, що каталізується цим ферментом. У більшості ситуацій, що становлять інтерес для біохіміків, концентрація ферменту дуже мала, а субстрат є у надлишку. Крім того, біохіміки досліджують процеси, що досягли стаціонарного стану, при якому утворення фермент-субстратного комплексу врівноважується його перетворенням на продукт. У умовах залежність швидкості (v) ферментативного перетворення субстрату з його концентрації [[S]] описується рівнянням Міхаеліса - Ментен:

де KM – константа Міхаеліса, що характеризує активність ферменту, V – максимальна швидкість реакції при даній сумарній концентрації ферменту. На цьому рівняння випливає, що з малих [[S]] швидкість реакції зростає пропорційно концентрації субстрату. Проте за досить великому збільшенні останньої ця пропорційність зникає: швидкість реакції перестає залежати від [[S]] - настає насичення, коли молекули ферменту виявляються зайнятими субстратом. З'ясування механізмів дії ферментів переважають у всіх деталях - справа майбутнього, проте деякі важливі їх особливості вже встановлено. Кожен фермент має один або кілька активних центрів, з якими зв'язується субстрат. Ці центри високоспецифічні, тобто. "дізнаються" тільки "свій" субстрат або близькі споріднені з'єднання. Активний центр формують спеціальні хімічні групи в молекулі ферменту, орієнтовані друг щодо друга певним чином. Втрата ферментативної активності, що відбувається так легко, пов'язана саме зі зміною взаємної орієнтації цих груп. Молекула субстрату, пов'язаного з ферментом, зазнає змін, в результаті яких розриваються одні та утворюються інші хімічні зв'язки. Щоб цей процес відбувся, потрібна енергія; роль ферменту полягає у зниженні енергетичного бар'єру, який треба подолати субстрату для перетворення на продукт. Як саме забезпечується таке зниження – до кінця не встановлено.
Ферментативні реакції та енергія.Вивільнення енергії при метаболізмі поживних речовин, наприклад, при окисленні шестивуглецевого цукру глюкози з утворенням діоксиду вуглецю та води, відбувається в результаті послідовних узгоджених ферментативних реакцій. У тваринних клітинах у перетвореннях глюкози на піровиноградну кислоту (піруват) або молочну кислоту (лактат) беруть участь 10 різних ферментів. Цей процес називається гліколізом. Перша реакція – фосфорилювання глюкози – вимагає участі АТФ. На перетворення кожної молекули глюкози на дві молекули піровиноградної кислоти витрачаються дві молекули АТФ, але при цьому на проміжних етапах аденозиндифосфату (АДФ) утворюються 4 молекули АТФ, так що весь процес в цілому дає 2 молекули АТФ. Далі піровиноградна кислота окислюється до діоксиду вуглецю та води за участю ферментів, асоційованих з мітохондріями. Ці перетворення утворюють цикл, званий циклом трикарбонових кислот, або циклом лимонної кислоти.
також МЕТАБОЛІЗМ. Окислення однієї речовини завжди пов'язані з відновленням іншого: перше віддає атом водню, а друге його приєднує. Каталізують ці процеси дегідрогенази, що забезпечують перенесення атомів водню від субстратів до коферментів. У циклі трикарбонових кислот одні специфічні дегідрогенази окислюють субстрати з утворенням відновленої форми коферменту (нікотинаміддинуклеотиду, що позначається НАД), а інші окислюють відновлений кофермент (НАДЧН), відновлюючи інші дихальні ферменти, у тому числі цитохроми. окислюється, то відновлюється. Зрештою відновлена ​​форма цитохромоксидази, одного з ключових залізовмісних ферментів, окислюється киснем, що потрапляє в наш організм з повітрям, що вдихається. Коли відбувається горіння цукру (окислення киснем повітря), атоми вуглецю, що входять до його складу, безпосередньо взаємодіють з киснем, утворюючи діоксид вуглецю. На відміну від горіння, при окисненні цукру в організмі кисень окислює власне залізо цитохромоксидази, але зрештою його окисний потенціал використовується для повного окиснення цукрів у ході багатоступінчастого процесу, опосередкованого ферментами. На окремих етапах окиснення енергія, укладена в поживних речовинах, вивільняється переважно маленькими порціями і може запасатися у фосфатних зв'язках АТФ. У цьому беруть участь чудові ферменти, які поєднують окисні реакції (що дають енергію) з реакціями утворення АТФ (що запасають енергію). Цей процес сполучення відомий як окисне фосфорилювання. Якби не було пов'язаних ферментативних реакцій, життя у відомих нам формах було б неможливим. Ферменти виконують і багато інших функцій. Вони каталізують різноманітні реакції синтезу, включаючи утворення тканинних білків, жирів та вуглеводів. Для синтезу всієї величезної кількості хімічних сполук, виявлених у складних організмах, застосовуються цілі ферментні системи. Для цього потрібна енергія, і у всіх випадках її джерелом є фосфорильовані сполуки, такі, як АТФ.

Ферменти та травлення.Ферменти – необхідні учасники процесу травлення. Тільки низькомолекулярні сполуки можуть проходити через стінку кишечника і потрапляти в кровообіг, тому компоненти їжі повинні бути розщеплені попередньо до невеликих молекул. Це відбувається в ході ферментативного гідролізу (розщеплення) білків до амінокислот, крохмалю до цукрів, жирів до жирних кислот та гліцерину. Гідроліз білків каталізує фермент пепсин, що міститься у шлунку. Ряд високоефективних травних ферментів секретує в кишечник підшлункова залоза. Це трипсин та хімотрипсин, що гідролізують білки; ліпаза, що розщеплює жири; амілаза, що каталізує розщеплення крохмалю. Пепсин, трипсин та хімотрипсин секретуються у неактивній формі, у вигляді т.зв. зимогенів (проферментів), і переходять в активний стан лише у шлунку та кишечнику. Це пояснює, чому зазначені ферменти не руйнують клітини підшлункової залози та шлунка. Стінки шлунка та кишечника захищає від травних ферментів та шар слизу. Деякі важливі травні ферменти секретуються клітинами тонкого кишківника. Більшість енергії, запасеної в рослинній їжі, такий, як трава або сіно, зосереджена в целюлозі, яку розщеплює фермент целюлаза. В організмі травоїдних тварин цей фермент не синтезується, і жуйні, наприклад велика рогата худоба і вівці, можуть харчуватися їжею, що містить целюлозу, тільки тому, що целюлазу виробляють мікроорганізми, що заселяють перший відділ шлунка - рубець. За допомогою мікроорганізмів відбувається перетравлення їжі та у термітів. Ферменти знаходять застосування у харчовій, фармацевтичній, хімічній та текстильній промисловості. Як приклад можна навести рослинний фермент, що отримується з папайї і використовуваний для розм'якшення м'яса. Ферменти додають також у пральні порошки.
Ферменти в медицині та сільському господарстві.Усвідомлення ключової ролі ферментів у всіх клітинних процесах призвело до широкого їх застосування в медицині та сільському господарстві. Нормальне функціонування будь-якого рослинного та тваринного організму залежить від ефективної роботи ферментів. В основі дії багатьох токсичних речовин (отрут) лежить їхня здатність інгібувати ферменти; таким же ефектом має і низка лікарських препаратів. Нерідко дію лікарського препарату або токсичної речовини можна простежити за його вибірковим впливом на роботу певного ферменту в організмі в цілому або в тій чи іншій тканині. Наприклад, потужні фосфорорганічні інсектициди і нервово-паралітичні гази, розроблені у військових цілях, мають свій згубний ефект, блокуючи роботу ферментів - насамперед холінестерази, що грає важливу роль у передачі нервового імпульсу. Щоб краще зрозуміти механізм дії лікарських засобів на ферментні системи, корисно розглянути, як працюють деякі інгібітори ферментів. Багато інгібіторів зв'язуються з активним центром ферменту – тим самим, з яким взаємодіє субстрат. У таких інгібіторів найбільш важливі структурні особливості близькі до структурних особливостей субстрату, і якщо в реакційному середовищі присутні субстрат і інгібітор, між ними спостерігається конкуренція за зв'язування з ферментом; при цьому чим більша концентрація субстрату, тим успішніше він конкурує з інгібітором. Інгібітори іншого типу індукують у молекулі ферменту конформаційні зміни, до яких залучаються важливі у функціональному відношенні хімічні групи. Вивчення механізму дії інгібіторів допомагає хімікам створювати нові лікарські препарати.

Тема: «ВЛАСТИВОСТІ І КЛАСИФІКАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ. ВПЛИВ ТЕМПЕРАТУРИ І РН СЕРЕДОВИЩА НА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ. СПЕЦИФІЧНІСТЬ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ. ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ»

1. Хімічна природа ферментів. Значення ферментів для життєдіяльності організму.

2. Основні властивості ферментів. Вплив концентрації ферменту та субстрату, температури та рН середовища на швидкість ферментативної реакції. Олігодинамічність та оборотність дії ферментів.

3. Специфічність дії ферментів (абсолютна, відносна та стереохімічна). приклади.

4. Найважливіша ознака, покладена основою класифікації ферментів. Концепція кодового номера ферменту. Класи ферментів: оксидоредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази, лігази. Тип і загальне рівняння реакцій, що каталізуються, принципи формування підкласів.

5. Номенклатура ферментів (поняття про систематичне і робоче (рекомендоване) назви ферментів, їх використання).

6. Визначення активності ферментів. Аналітичні методи, що застосовуються визначення активності. Одиниці загальної, питомої, молекулярної активності ферментів, використання. Формула для розрахунку загальної активності ферменту у сироватці крові.

Розділ 7.1	Хімічна природа ферментів. Значення ферментів для життєдіяльності організму.
7.1.1. Перебіг процесів обміну речовин, у організмі визначається дією численних ферментів — біологічних каталізаторів білкової природи. Вони прискорюють хімічні реакції і при цьому не витрачаються. Термін "фермент"походить від латинського слова fermentum - Закваска. Поряд із цим поняттям у літературі використовується рівноцінний термін «ензим» (en zyme - у дріжджах) грецького походження. Звідси розділ біохімії, що вивчає ферменти, дістав назву «ензимологія». Ензимологія становить основу пізнання на молекулярному рівні найважливіших проблем фізіології та патології людини. Перетравлення харчових речовин та їх використання для вироблення енергії, утворення структурних та функціональних компонентів тканин, скорочення м'язів, передача електричних сигналів по нервових волокнах, сприйняття світла оком, згортання крові – кожен із цих фізіологічних механізмів має в основі каталітичну дію певних ферментів. Було показано, що численні захворювання безпосередньо порушення ферментативного каталізу; визначення активності ферментів у крові та інших тканинах дає цінні відомості для медичної діагностики; ферменти або їх інгібітори можуть застосовуватись як лікарські речовини. Таким чином, знання найважливіших особливостей ферментів та каталізованих ними реакцій необхідно при раціональному підході до вивчення захворювань людини, їх діагностики та лікування. 7.1.2. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називаються субстратами . Фермент, з'єднуючись із субстратом, утворює фермент-субстратний комплекс (Рисунок 7.1). Малюнок 7.1.Утворення фермент-субстратного комплексу в ході реакції, що каталізується. Утворення цього комплексу сприяє зниженню енергетичного бар'єру, який необхідно подолати молекулі субстрату для вступу в реакцію (рис. 7.2). По завершенні реакції фермент-субстратний комплекс розпадається на продукт (продукти) та фермент. Фермент після закінчення реакції повертається у свій вихідний стан і може взаємодіяти з новою молекулою субстрату. Рисунок 7.2.Вплив ферменту на енергетичний бар'єр реакції. Ферменти, діючи як каталізатори, знижують енергію активації, яка потрібна для того, щоб відбулася реакція. 7.1.3. Для ферментів характерні властивості, властиві всім білкам. Зокрема молекули ферментів, як і інших білків, побудовані з α-амінокислот, з'єднаних пептидними зв'язками. Тому розчини ферментів дають позитивну біуретову реакцію, А їх гідролізати - позитивну нінгідринову реакцію. Нативні властивості та функції ферментів визначаються наявністю певної просторової структури (конформації) їхнього поліпептидного ланцюга. Зміна цієї структури в результаті теплової денатураціїпризводить до втрати каталітичних властивостей. Наявність у ферментів високої молекулярної маси зумовлює їх нездатність до діалізу, а присутність у молекулах заряджених функціональних груп - рухливість в електричному полі. Як і інші білки, ферменти утворюють колоїдні розчини, з яких можуть осаджуватися ацетоном, спиртом, сульфатом амонію.- речовинами, що сприяють руйнуванню гідратної оболонки та нейтралізації електричного заряду.

Розділ 7.2	Основні властивості ферментів. Олігодинамічність та оборотність дії ферментів. Вплив концентрації ферменту та субстрату, температури та рН середовища на швидкість ферментативної реакції.
7.2.1. Білкова природа ферментів зумовлює появу вони низки властивостей, загалом нехарактерних для неорганічних каталізаторів: олігодинамічність, специфічність, залежність швидкості реакції від температури, рН середовища, концентрації ферменту і субстрату, присутності активаторів та інгібіторів. Під олігодинамічністюферментів розуміють високу ефективність дії у дуже малих кількостях. Така висока ефективність пояснюється тим, що молекули ферментів у процесі своєї каталітичної діяльності безперервно регенерують. Типова молекула ферменту може регенерувати мільйони разів на хвилину. Треба сказати, що і неорганічні каталізатори також здатні прискорювати перетворення такої кількості речовин, яка значно перевищує їх власну масу. Але жоден неорганічний каталізатор не може зрівнятися з ферментами ефективності дії. Прикладом може бути фермент реннин, вироблюваний слизової оболонкою шлунка жуйних тварин. Одна молекула його за 10 хвилин при 37 ° С здатна викликати коагуляцію (створення) близько мільйона молекул казеїногену молока. Інший приклад високої ефективності ферментів дає каталаза. Одна молекула цього ферменту за 0°С розщеплює за секунду близько 50 000 молекул пероксиду водню: 2 Н 2 О2 2 Н2 О + О2 Дія каталази на пероксид водню полягає у зміні величини енергії активації цієї реакції приблизно від 75 кДж/моль без каталізатора до 21 кДж/моль у присутності ферменту. Якщо ж як каталізатор цієї реакції використовується колоїдна платина, то енергія активації становить всього 50 кДж/моль. 7.2.2. При вивченні впливу будь-якого фактора на швидкість ферментативної реакції, всі інші фактори повинні залишатися незмінними і по можливості мати оптимальне значення. Мірою швидкості ферментативних реакцій служить кількість субстрату, що зазнав перетворення в одиницю часу, або кількість продукту, що утворився. Зміна швидкості проводять на початковій стадії реакції, коли продукт практично немає, і зворотна реакція не йде. Крім того, на початковій стадії реакції концентрація субстрату відповідає його вихідній кількості. 7.2.3. Залежність швидкості ферментативної реакції ( V ) від концентрації ферменту [Е](Рисунок 7.3). При високій концентрації субстрату (що багаторазово перевищує концентрацію ферменту) і при сталості інших факторів швидкість ферментативної реакції пропорційна концентрації ферменту. Тому знаючи швидкість реакції, що каталізується ферментом, можна зробити висновок про його кількість у досліджуваному матеріалі. Малюнок 7.3.Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації ферменту 7.2.4. Залежність швидкості реакції від концентрації субстрату[S]. Графік залежності має вигляд гіпербол (рисунок 7.4). При постійній концентрації ферменту швидкість реакції, що каталізується, зростає зі збільшенням концентрації субстрату до максимальної величини Vmax, після чого залишається постійною. Це слід пояснити тим, що при високих концентраціях субстрату, всі активні центри молекул ферменту виявляються пов'язаними з молекулами субстрату. Будь-яка надмірна кількість субстрату може з'єднатися з ферментом лише після того, як утворюється продукт реакції та звільниться активний центр. Малюнок 7.4.Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату. Залежність швидкості реакції від концентрації субстрату може бути виражена рівнянням Міхаеліса - Ментен: , де V - швидкість реакції при концентрації субстрату [S], Vmax -максимальна швидкість і KM-константа Міхаеліса. Константа Міхаеліса дорівнює концентрації субстрату, за якої швидкість реакції становить половину максимальної. Визначення KM та Vmax має важливе практичне значення, оскільки дозволяє кількісно описати більшість ферментативних реакцій, включаючи реакції за участю двох та більше субстратів. Різні хімічні речовини, що змінюють активність ферментів, по-різному впливають величини Vmax і KM . 7.2.5. Залежність швидкості реакції від t - температури, за якої протікає реакція (Рисунок 7.5), має складний характер. Значення температури, у якому швидкість реакції максимальна, є температурний оптимум ферменту. Температурний оптимум більшості ферментів людини приблизно дорівнює 40°С. Для більшості ферментів оптимальна температура дорівнює або вище за тойц температури, при якій знаходяться клітини. Малюнок 7.5.Залежність швидкості ферментативної реакції від температури. При нижчих температурах (0 ° - 40 ° С) швидкість реакції збільшується зі зростанням температури. При підвищенні температури на 10°С швидкість ферментативної реакції подвоюється (температурний коефіцієнт Q10 дорівнює 2). Підвищення швидкості реакції пояснюється збільшенням кінетичної енергії молекул. При подальшому підвищенні температури відбувається розрив зв'язків, що підтримують вторинну та третинну структуру ферменту, тобто теплову денатурацію. Це супроводжується поступовою втратою каталітичної активності. 7.2.6. Залежність швидкості реакції від рН середовища (Рисунок 7.6). При постійній температурі фермент працює найефективніше у вузькому інтервалі рН. Значення рН, у якому швидкість реакції максимальна, є оптимум рН ферменту. У більшості ферментів організму людини оптимум рН знаходиться в межах рН 6 - 8, але є ферменти, які активні при значеннях рН, що лежать поза цим інтервалом (наприклад, пепсин, найбільш активний при рН 1,5 - 2,5). Зміна рН як у кислу, так і в лужну сторону від оптимуму призводить до зміни ступеня іонізації кислих та основних груп амінокислот, що входять до складу ферменту (наприклад, СООН-групи аспартату та глутамату, NН2-групи лізину тощо). Це спричиняє зміну конформації ферменту, внаслідок чого змінюється просторова структура активного центру та зниження його спорідненості до субстрату. Крім того, при екстремальних значеннях рН відбувається денатурація ферменту та його інактивація. Малюнок 7.6.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН середовища. Слід зазначити, що властивий ферменту оптимум рН який завжди збігається з рН його безпосереднього внутрішньоклітинного оточення. Це дозволяє припустити, що середовище, в якому знаходиться фермент, певною мірою регулює його активність. 7.2.7. Залежність швидкості реакції від присутності активаторів та інгібіторів . Активатори збільшують швидкість ферментативної реакції. Інгібітори знижують швидкість ферментативної реакції. Як активатори ферментів можуть виступати неорганічні іони. Припускають, що ці іони змушують молекули ферменту чи субстрату прийняти конформацію, що сприяє утворенню фермент-субстратного комплексу. Тим самим збільшується ймовірність взаємодії ферменту та субстрату, а відтак і швидкість реакції, що каталізується ферментом. Так, наприклад, активність амілази слини підвищується у присутності хлорид-іонів.

Розділ 7.3	Специфічність дії ферментів (абсолютна, відносна та стереохімічна).
7.3.1. Важливою властивістю, що відрізняє ферменти від неорганічних каталізаторів, є специфічність дії. Як відомо, структура активного центру ферменту комплементарна структурі його субстрату. Тому фермент із усіх наявних у клітині речовин вибирає і приєднує лише свій субстрат. Для ферментів характерна специфічність як щодо субстрату, а й щодо шляху перетворення субстрату. У ферментів розрізняють абсолютну, відносну та стереохімічну специфічність. 7.3.2. Абсолютна специфічність- вибіркова здатність ферменту каталізувати лише одне з можливих перетворень одного субстрату. Це можна пояснити конформаційною та електростатичною комплементарністю молекул субстрату та ферменту. Наприклад, фермент аргіназа каталізує лише гідроліз амінокислоти аргініну, фермент уреазу – лише розщеплення сечовини та не діють на інші субстрати. 7.3.3. Відносна специфічність- вибіркова здатність ферменту каталізувати однотипні перетворення подібних до будови субстратів. Такі ферменти впливають на однакові функціональні групи або на той самий тип зв'язків у молекулах субстратів. Так, наприклад, різні гідролітичні ферменти діють на певний тип зв'язків: амілаза – на глікозидні зв'язки; пепсин та трипсин - на пептидні зв'язки; ліпаза та фосфоліпаза - на складноефірні зв'язки. Дія цих ферментів поширюється на велику кількість субстратів, що дозволяє організму обійтися малою кількістю травних ферментів - інакше їх потрібно набагато більше. 7.3.4. Стереохімічна (оптична) специфічність- вибіркова здатність ферменту каталізувати перетворення лише одного з можливих просторових ізомерів субстрату. Так, більшість ферментів ссавців каталізує перетворення толькл L-ізомерів амінокислот, але не D-ізомерів. ферменти, що беруть участь в обміні моносахаридів, навпаки, каталізують перетворення лише D-, але не L-фосфоцукорів. Глікозидази специфічні не тільки до моносахаридного фрагменту, а й до характеру глікозидного зв'язку. Наприклад, α-амілаза розщеплює α-1,4-глікозидні зв'язки в молекулі крохмалю, але не діє на α-1,2-глікозидні зв'язки у молекулі сахарози.

Розділ 7.4	Основні принципи, покладені основою сучасної класифікації та номенклатури ферментів.
7.4.1. В даний час відомо більше двох тисяч хімічних реакцій, що каталізуються ферментами, і це число безперервно зростає. Щоб орієнтуватися в такому безлічі перетворень. виникла нагальна потреба в систематизованій класифікації та номенклатурі, за допомогою якої будь-який фермент можна було б точно ідентифікувати. Номенклатура, якою користувалися до середини ХХ століття, була дуже далека від досконалості. Дослідники, відкриваючи новий фермент, давали йому назву на власний розсуд, що неминуче вело до плутанини та всіляких протиріч. Деякі назви виявилися помилковими, інші нічого не говорили про природу реакції, що каталізується. Вчені різних шкіл часто вживали різні назви для одного і того ж ферменту або, навпаки, одна й та сама назва для декількох різних ферментів. Було вирішено розробити раціональну міжнародну класифікацію та номенклатуру ферментів, якою могли б користуватися біохіміки всіх країн. З цією метою при Міжнародному союзі біохімії та молекулярної біології була створена Комісія з ферментів, яка запропонувала в 1964 році основні принципи такої класифікації та номенклатури. Вона постійно вдосконалюється та доповнюється, нині діє вже шоста редакція цієї номенклатури (1992 рік), до якої щороку виходять доповнення.

7.4.2. В основу класифікації покладено найважливішу ознаку, за якою один фермент відрізняється від іншого - це реакція, що каталізується. Число типів хімічних реакцій порівняно невелике, що дозволило розділити всі відомі в даний час ферменти на 6 найважливіших класів, в залежності від типу реакції, що каталізується. Такими класами є:

• оксидоредуктази (окислювально-відновлювальні реакції);
• трансферази (перенесення функціональних груп);
• гідролази (реакції розщеплення за участю води);
• ліази (розрив зв'язків без участі води);
• ізомерази (ізомерні перетворення);
• лігази (синтез із витратою молекул АТФ).

7.4.3. Ферменти кожного класу поділяють на підкласи, керуючись будовою субстратів. У підкласи поєднують ферменти, що діють на подібно побудовані субстрати. Підкласи розбивають на підпідкласи,вяких ще суворіше уточнюють структуру хімічних груп, що відрізняють субстрати друг від друга. Усередині підпідкласів перераховують Індивідуальні ферменти. Усі підрозділи класифікації мають номери. Таким чином, будь-який фермент отримує свій унікальний кодовий номер, що складається із чотирьох чисел, розділених точками. Перше число позначає клас, друге – підклас, третє – підпідклас, четверте – номер ферменту в межах підпідкласу. Наприклад, фермент α-амілаза, що розщеплює крохмаль, позначається як 3.2.1.1, де:
3 - тип реакції (гідроліз);
2 - тип зв'язку в субстраті (глікозидний);
1 - різновид зв'язку (О-глікозидний);
1 - номер ферменту в підпідкласі

Вищеописаний десятковий спосіб нумерації має одну важливу перевагу: він дозволяє оминути головну незручність наскрізної нумерації ферментів, а саме: необхідність при включенні до списку новоствореного ферменту змінювати номери всіх наступних. Новий фермент може бути поміщений наприкінці відповідного підпідкласу без порушення решти нумерації. Так само при виділенні нових класів, підкласів та підпідкласів їх можна додавати без порушення порядку нумерації раніше встановлених підрозділів. Якщо після отримання нової інформації виникає необхідність змінити номери на деякі ферменти, колишні номери не привласнюють новим ферментам, щоб уникнути непорозумінь.

Говорячи про класифікацію ферментів, слід зазначити, що ферменти класифікуються не як індивідуальні речовини, бо як каталізатори певних хімічних перетворень. Ферменти, виділені з різних біологічних джерел і ідентичні реакції, що каталізують, можуть істотно відрізнятися за своєю первинною структурою. Проте в класифікаційному списку всі вони фігурують під тим самим кодовим номером.

Отже, знання кодового номера ферменту дозволяє:

• усунути неоднозначності, якщо різні дослідники використовують одну й ту саму назву для різних ферментів;
• зробити пошук інформації у літературних базах даних ефективнішим;
• отримати в інших базах даних додаткову інформацію про послідовність амінокислот, просторову структуру ферменту, гени, що кодують ферментні білки.

розділ 7.5

Поняття про систематичну та робочу назву ферменту, їх використання.

7.5.1. Система класифікації, розроблена Комісією з ферментів, включає також і новостворену номенклатуру ферментів, яка будується за спеціальними принципами. Згідно з рекомендаціями IUBMB, ферменти отримують два роди назв: систематичне та робоче (рекомендоване).

7.5.2. Систематична назваскладається із двох частин. Перша частина містить назву субстрату або субстратів, часто - найменування коферменту, друга частина вказує на природу реакції, що каталізується, і включає назву класу, до якого відноситься даний фермент. При необхідності наводиться додаткова інформація про реакцію у дужках після другої частини назви. Систематична назва присвоюється лише тим ферментам, каталітична дія яких повністю вивчена.

Наприклад, систематична назва α-амілази 1,4-α-D-глюкан-глюканогідролаза . Звичайно, така назва дуже незручна для запам'ятовування та вимовлення. Тому поряд із систематичними Комісія з ферментів IUBMB дає рекомендує використовувати робочі (спрощені) назви ферментів.

7.5.3. Робоча назваферменту має бути досить коротким для вживання. Як робочої назви у ряді випадків може бути використана тривіальна назва, якщо вона не є помилковою або двозначною. В інших випадках воно будується на тих самих загальних принципах, що й систематична назва, але з мінімальною деталізацією. Конкретні приклади систематичних і робочих назв ферментів наводяться у розділі цієї теми курсу. У наукових публікаціях при першій згадці про фермент прийнято вказувати його систематичну назву та кодовий номер, а надалі користуватися його робочою назвою.

7.5.4. Основні правила побудови систематичних та робочих назв різних класів ферментів:

Оксидоредуктази

Систематична назва ферментів цього класу будується за схемою донор: акцептор – оксидоредуктаза.Згідно з тривіальною номенклатурою, оксидоредуктази, що відщеплюють атоми водню або електрони і переносять їх на будь-який акцептор, крім кисню, називаються дегідрогенази. Оксидоредуктази, що використовують кисень як акцептор атомів водню або електронів, називаються оксидазами. Деякі ферменти, яким властива переважно відновлююча дія, звуться редуктаз. Усі перелічені найменування можуть бути використані для побудови робочої назви оксидоредуктаз.

Трансферази

Систематична назва ферментів, що прискорюють такі реакції, складають за формою донор: акцептор (транспортована група) трансфераза.В робочій назві зазвичай вказується лише один специфічний субстрат або продукт поряд з назвою угруповання, що транспортується.

Гідролази

Систематична назва складається за формою субстрат-гідролаза.У гідролаз, що специфічно відщеплюють певну групу, ця група може бути зазначена у вигляді префіксу. Робоча назва найчастіше складається з назви субстрату, що гідролізується, з додаванням закінчення -аза. Слід, проте, відзначити, що внаслідок досить складного і найчастіше остаточно не виявленого характеру специфічності багатьох гідролаз який завжди вдається дати їм систематичну назву. У цих випадках рекомендовано використовувати емпіричні назви, надані їм при першому описі. Так, не мають систематичної назви такі ферменти, як пепсин, папаїн, тромбін.

Ліази

Систематична назва ферментів будується за схемою: субстрат-що відщеплюється група-ліаза.Щоб уточнити, яка група відщеплюється, застосовуються префікси "карбокси-", "аміак", "гідро-" і т.д. В якості робочих назв ферментів зберігаються тривіальні назви типу "декарбоксилаза", "альдолаза", "дегідратаза", "десульфгідраза". Ліази поділяються на підкласи залежно від характеру зв'язків, що розриваються.

Ізомерази

Систематична назва ферментів включає назву субстрату та слово ізомераза, якому передує вказівку типу реакції ізомеризації. Робочі назви подібні (з деякими спрощеннями) систематичним назвам.

Лігази

Систематична назва утворюється з назв субстратів, що з'єднуються в поєднанні зі словом лігаза.У дужках вказується продукт, що утворюється внаслідок гідролізу нуклеозидтрифосфату (наприклад, АДФ або АМФ). Робоча назва ферментів цього класу складається, як правило, із назви продукту реакції у поєднанні зі словом синтетазу.

Рекомендація. Знайомлячись у подальшому з різними ферментативними реакціями, завжди аналізуйте сутність змін, які у субстратах, і намагайтеся визначити по крайнього заходу клас ферменту, що каталізує реакцію. Аналізуйте також назви ферментів та співвідносите їх з процесами, що відбуваються у реакціях. Це полегшить запам'ятовування назв ферментів і каталізованих ними перетворення і дозволить більше часу приділити з'ясування біологічної ролі досліджуваних процесів.

Розділ 7.6.1	ОКСИДОРЕДУКТАЗИ.
До класу оксидоредуктаз відносять ферменти, що каталізують окисно-відновлювальні реакції. Загальна схема їх може бути представлена ​​таким чином: де AH2 -донор водню, B - акцептор водню. У живих організмах окиснення здійснюється переважно шляхом відщеплення атомів водню або електронів від субстратів-донорів. Акцепторами атомів водню чи електронів може бути різні речовини - коферменти (НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, глутатіон, ліпоєва кислота, убихинон), цитохроми. залізосерні білки та кисень. Підкласи оксидоредуктазу формуються залежно від природи функціональної групи донора водню (електронів). Усього виділяють 19 підкласів. Основними є такі: Оксидоредуктази, що діють на СН-ОН-групу донорів. Ферменти, що належать до цього підкласу, окислюють спиртові групи до альдегідних або кетонних груп. Як приклад можна навести фермент алкогольдегідрогеназу (алкоголь: НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.1). що бере участь у метаболізмі етанолу в тканинах: Крім окислення спиртів, ферменти цього підкласу беруть участь у дегідруванні оксикислот (молочної, яблучної, ізолімонної), моносахаридів та інших сполук, що містять гідроксильні групи. Оксидоредуктази, що діють на альдегідну або кетонну групу донорів. Ці ферменти окислюють альдегіди та кетони до карбонових кислот. Наприклад, представник цього підкласу - гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (D-гліцеральдегід-3-фосфат: НАД-оксидоредуктаза (фосфорилуюча), КФ 1.2.1.12) - каталізує одну з проміжних реакцій розпаду глюкози: Важливо відзначити, що продукт цієї реакції містить багату енергією фосфатний зв'язок в 1-му положенні. Залишок фосфорної кислоти, що утворює цей зв'язок, може бути перенесений від 1,3-дифосфогліцерату на АДФ з утворенням АТФ (див. далі). Оксидоредуктази, що діють на СН-СН-групу донорів. В результаті каталізованих ними реакцій СН-СН-групи перетворюються на С=С-групи. тобто відбувається утворення ненасичених сполук із насичених. Наприклад, фермент циклу трикарбонових кислот сукцинатдегідрогеназу (Сукцинат:акцептор - оксидоредуктаза, КФ 1.3.99.1) прискорює окислення бурштинової кислоти з утворенням ненасиченої фумарової кислоти: Оксидоредуктази, що діють на CH-NH2 -групу донорів. Ці ферменти каталізують окисне дезамінування амінокислот та біогенних амінів. Аміни при цьому перетворюються на альдегіди або кетони, амінокислоти - на кетокислоти і виділяється аміак. Так, глутаматдегідрогеназа (L-глутамат:НАД(Ф) - оксидоредуктаза (дезамінуючий), КФ 1.4.1.3) бере участь у наступному перетворенні глутамату: Оксидоредуктази, що діють на сірковмісні групи донорів, каталізують окиснення тіолових (сульфгідрильних) груп до дисульфідних, а сульфітів - до сульфатів. Прикладом ферменту є дигідроліпоїлдегідрогеназа (КФ 1.8.1.4), що каталізує одну з проміжних реакцій окисного декарбоксилювання пірувату: Оксидоредуктази, що діють на пероксид водню як акцептор, порівняно нечисленні та об'єднані в окремий підклас, відомий також під тривіальною назвою пероксидази. Прикладом ферменту є глутатіонпероксидаза (глутатіон:Н2 О2 - оксидоредуктаза. КФ 1.11.1.9), що бере участь в інактивації пероксиду водню в еритроцитах, печінці та деяких інших тканинах: Оксидоредуктази, що діють на пару донорів із включенням молекулярного кисню, або монооксигенази - ферменти, що каталізують окиснення органічних сполук молекулярним киснем, що призводить до включення одного з атомів кисню до молекул цих сполук. При цьому другий атом кисню входить у молекулу води. Так реакція перетворення фенілаланіну на тирозин каталізується фенілаланін-4-монооксигеназою (КФ 1.14.16.1): У деяких людей генетичний дефект цього ферменту спричинює захворювання, яке зветься фенілкетонурією. До монооксигеназ відноситься також фермент, відомий під назвою цитохром Р450 (КФ 1.14.14.1) Він міститься, головним чином, у клітинах печінки та здійснює гідроксилювання чужих організму ліпофільних сполук, що утворюються як побічні продукти реакцій або потрапляють в організм ззовні. Наприклад, індол, що утворюється з триптофану в результаті діяльності мікроорганізмів кишечника, піддається в печінці гідроксилювання за наступною схемою: Поява гідроксильної групи підвищує гідрофільність речовин та полегшує їх подальше виведення з організму. Крім того, цитохром Р450 бере участь в окремих етапах перетворення холестерину та стероїдних гормонів. Наявність у живих організмів високоефективної системи цитохрому Р450 призводить у ряді випадків до небажаних практичних наслідків: скорочує час перебування в організмі людини лікарських препаратів і тим самим знижує їх терапевтичний ефект. Оксидоредуктази, що діють на один донор із включенням молекулярного кисню, або діоксигенази, каталізують перетворення, в ході яких обидва атоми молекули О2 включаються до складу субстрату, що окислюється. Наприклад, у процесі катаболізму фенілаланіну та тирозину відбувається утворення з гомогентизинової кислоти малеїлацетоацетату, до складу якого включаються обидва атоми кисню: Фермент, який каталізує цю реакцію, називається гомогентизат-1,2-діоксигеназою(КФ 1.13.11.5). У ряді випадків зустрічається вроджений дефіцит цього ферменту, що призводить до розвитку захворювання, що називається алкаптонурією.

Розділ 7.6.2	Трансфери.
Трансферази – клас ферментів, що каталізують перенесення функціональних груп від однієї сполуки до іншої. Загалом ці перетворення можна записати: де Х - функціональна група, що переноситься. AX – донор угруповання, В – акцептор. Підрозділ на підкласи залежить від природи угруповань, що переносяться. Трансферази, що переносять одновуглецеві фрагменти. До цього підкласу відносяться ферменти, що прискорюють перенесення метильних (-CH3), метиленових (-СН2 -), метенільних (-СН =), формальних і споріднених їм груп. Так, за участю гуанідинацетат-метилтрансферази (S-аденозилметіонінгуанідинацетат-метилтрансфераза, КФ 2.1.1.2) відбувається синтез біологічно активної речовини креатину: Трансферази, що переносять залишки карбонових кислот (ацилтрансферази). Вони каталізують різноманітні хімічні процеси пов'язані з перенесенням залишків різних кислот (оцтової, пальмітинової та ін) переважно від тіоефірів коензиму А на різні акцептори. Прикладом реакції трансацетилювання може бути утворення медіатора ацетилхоліну за участю холін-ацетилтрансферази (ацетил-КоА:холін-О-ацетилтрансфераза, КФ 2.3.1.6): Трансферази, що переносять глікозильні залишки (глікозилтрансфрази), каталізують транспорт глікозильних залишків із молекул фосфорних ефірів до молекул моносахаридів, полісахаридів та інших речовин. Ці ферменти, зокрема, відіграють основну роль у синтезі глікогену та крохмалю, а також у першій фазі їх деструкції. Ще один фермент цього підкласу - УДФ-глюкуронілтрансфераза (УДФ-глюкуронат-глюкуроніл-трансфераза (неспецифічна до акцептора), КФ 2.4.1.17) - бере участь у процесах знешкодження ендогенних та чужорідних токсичних речовин у печінці: Трансферази, що переносять азотисті групи. До цього підкласу входять амінотрансферази, прискорюють перенесення α-аміногрупи амінокислот до α-вуглецевого атома кетокислот. Найбільш важливим з цих ферментів є аланінамінотрансфераза (L-аланін:2-оксоглутарат-амінотрансфераза, КФ 2.6.1.2). каталізуюча реакцію: Трансферази, які переносять фосфатні групи (фосфотрансферази). Ця група ферментів каталізує біохімічні процеси, пов'язані з транспортом залишків фосфорної кислоти різні субстрати. Зазначені процеси мають важливе значення для життєдіяльності організму, оскільки забезпечують перетворення низки речовин на органічні фосфоефіри, що мають високу хімічну активність і легко вступають у наступні реакції. Фосфотрансферази, які використовують як донора фосфату АТФ, прийнято називати кіназами . Широко поширеним ферментом є гексокіназа (ATФ:D-гексоза-6-фосфотрансфераза. КФ 2.7.1.1.), що прискорює перенесення фосфатної групи з АТФ на моносахариди: У деяких випадках можливе зворотне перенесення фосфатної групи з субстрату на АДФ з утворенням АТФ. Так, фермент фосфогліцераткіназа (АТФ:D-3-фосфогліцерат-1-фосфотрансфераза, КФ 2.7.2.3) здійснює перетворення згаданого раніше (див. "Оксидоредуктази") 1.3-дифосфогліцерату: Подібні реакції фосфорилювання АДФ з утворенням АТФ, пов'язані з перетворенням субстрату (а не з перенесенням електронів у дихальному ланцюзі), отримали назву реакцій субстратного фосфорилування Роль цих реакцій у клітині значно зростає при нестачі кисню у тканинах.

Розділ 7.6.3	Гідролази.
Гідролази – клас ферментів, що каталізують реакції розщеплення органічних сполук за участю води (реакції гідролізу). Ці реакції протікають за такою схемою: де А-В - складне з'єднання, А-Н і В-ВІН - продукти його гідролізу. Реакції цього активно протікають в організмі; вони йдуть з виділенням енергії і, як правило, необоротні. Підкласи гідролаз формуються залежно від типу гідролізованого зв'язку. Найважливішими є такі підкласи: Гідролази, що діють на складні ефіри (або естерази) гідролізують складні ефіри карбонової, фосфорної, сірчаної та інших кислот. Широко поширеним ферментом цього підкласу є триацилгліцеролліпаза (Гідролаза ефірів гліцеролу, КФ 3.1.1.3). прискорююча гідроліз ацилгліцеролів: Інші представники естераз розщеплюють складноефірні зв'язки в ацетилхоліну (ацетилхолінестераза), фосфоліпідах (фосфоліпази), нуклеїнових кислотах (нуклеази), фосфоорганічних ефірах (фосфатази). Гідролази, що діють на глікозидні зв'язки (глікозидази) прискорюють реакції гідролізу оліго- та полісахаридів, а також інших сполук, що містять моносахаридні залишки (наприклад, нуклеозидів). Характерним представником є сахараза (β-D-фруктофуранозід-фруктогідролаза, КФ 3.2.1.26). каталізуюча розщеплення сахарози: Гідролази, що діють на пептидні зв'язки (пептидази), каталізують реакції гідролізу пептидних зв'язків у білках та пептидах. До цієї групи належать пепсин, трипсин, хімотрипсин, катепсин та інші протеолітичні ферменти. Гідроліз пептидних зв'язків відбувається за такою схемою: Гідролази, що діють на C-N-зв'язку, що відрізняються від пептидних, - ферменти, що прискорюють гідроліз амідів органічних кислот. Представник цього підкласу - глутаміназ (L-глутаміл-амідогідролаза, КФ 3.5.1.2) - бере участь у підтримці кислотно-основного стану організму, каталізуючи у нирках гідроліз глутаміну:

Розділ 7.6.4	Ліази.
Ліази – клас ферментів, що каталізують негідролітичні реакції розщеплення субстратів з утворенням подвійних зв'язків або, навпаки, приєднання за місцем розриву подвійного зв'язку. Загальна схема цих реакцій: де А-В - субстрат, А і В - продукти реакції. В результаті таких реакцій часто виділяються прості речовини, наприклад, СО2, NH3, H2О. Вуглець-вуглець-ліази каталізують розрив зв'язку між двома атомами вуглецю. Серед них найбільше значення мають карбокси-ліази (декарбоксилази), під впливом яких здійснюється декарбоксилювання a-кето- і амінокислот, ліази кетокислот , до яких відноситься цитратсинтаза, Альдегід-ліази (альдолази). До останніх належить фруктозодифосфатальдолаза (фруктозо-1,6-дифосфат-D-гліцеральдегід-3-фосфат-ліаза, КФ 4.1.2.13), що каталізує реакцію: Вуглець-кисень-ліази каталізують розрив зв'язку між атомами вуглецю та кисню. У цей підклас входять насамперед гідроліази, що беруть участь у реакціях дегідратації та гідратації. Прикладом може бути сериндегідратаза (L-серин-гідро-ліаза (дезамінуючий), КФ 4.2.1.3), що здійснює перетворення: Іноді за основу робочої назви може бути прийнята зворотна реакція із застосуванням терміна "Гідратаза". Так, для ферменту циклу трикарбонових кислот L-малат-гідроліази (КФ 4.2.1.2) рекомендовано назву "фумаратгідратаза": Вуглець-азот-ліази беруть участь у відщепленні азотовмісних груп. Представником цього підкласу є гістидин-аміак-ліаза (L-гістидин-аміак-ліаза, КФ 4.3.1.3), що бере участь у дезамінуванні гістидину: Вуглець-сіра-ліази каталізують відщеплення сульфгідрильних груп. До цього підкласу належать десульфгідрази сірку містять амінокислот, наприклад, цистеїндесульфгідразу (L-цистеїн-сірководень-ліаза (дезамінуючий), КФ 4,4.1.1).

Розділ 7.6.5	ІЗОМЕРАЗИ.
Ізомерази - клас ферментів, що прискорюють процеси внутрішньомолекулярних перетворень з утворенням ізомерів. Схематично реакції такого типу можуть бути представлені таким чином: де А та А" - речовини-ізомери. Ізомерази - порівняно нечисленний клас ферментів, він поділяється на наступні підкласи залежно від типу каталізованої реакції ізомеризації: Рацемази та епімерази каталізують взаємоперетворення ізомерів, що містять асиметричні атоми вуглецю. Рацемазами називаються ферменти, що діють на субстрати з одним асиметричним атомом, наприклад, що перетворюють L-амінокислоти на D-амінокислоти. Одним з таких ферментів є аланінрацемаза (Аланін-рацемаза. КФ 5.1.1.1), що каталізує реакцію: Епімеразами називаються ферменти, які діють субстрати з кількома асиметричними атомами вуглецю. До таких ферментів належить УДФ-глюкозо-епімераза (УДФ-глюкоза-4-епімераза, КФ 5.1.3.2). що бере участь у процесах взаємоперетворення моносахаридів: Цис-транс-ізомерази - ферменти, що викликають зміну геометричної зміни щодо подвійного зв'язку. Прикладом такого ферменту є малеілацетоацетатизомераза (малеїлацетоацетат-цис-транс-ізомераза, КФ 5.2.1.2), що бере участь у катаболізмі фенілаланіну і тирозину і переводить малеілацетоацетат (див. 4.6.1) в фумарилацетоацетат: Внутрішньомолекулярні оксидоредуктази - ізомерази, що каталізують взаємоперетворення альдоз та кетоз. При цьому відбувається окиснення СН-ОН-групи з одночасним відновленням сусідньої С=О-групи. Так, тріозофосфатизомераза (D-гліцеральдегід-3-фосфат-кетол-ізомераза, КФ 5.3.1.1) каталізує одну з реакцій вуглеводного обміну: До ізомераз відносяться також внутрішньомолекулярні трансферази, здійснюють перенесення однієї групи з однієї частини молекули субстрату на іншу частину тієї ж молекули, та внутрішньомолекулярні ліази, каталізуючі реакції дециклізації, а також перетворення одного типу кільця на інший. Слід наголосити, що не всі біохімічні процеси. результатом яких є ізомеризація, що каталізуються ізомеразами. Так, ізомеризація лимонної кислоти в ізопімонну відбувається за участю ферменту аконітатгідратази (цитрат (ізоцитрат)-гідро-ліаза, КФ 4.2.1.3), каталізуючої реакції дегідратації-гідратації з проміжним утворенням цис-аконітової кислоти:

Розділ 7.6.6	Лігази.
Лігази - клас ферментів, що каталізують синтез органічних сполук із активованих за рахунок розпаду АТФ (або ГТФ, УТФ, ЦТФ) вихідних речовин. Для ферментів цього класу зберігається також тривіальна назва синтетази.Ву зв'язку з цим, згідно з рекомендаціями IUBMB, термін "синтетази" не повинен застосовуватися для ферментів, у дії яких не беруть участь нуклеозидтрифосфати. Реакції, що каталізуються лігазами (синтетазами), протікають за схемою: , де А і В – взаємодіючі речовини; А-В - речовина, що утворюється в результаті взаємодії. Оскільки в результаті дії цих ферментів утворюються нові хімічні зв'язки, підклас VI класу формуються залежно від характеру новостворених зв'язків. Лігази, що утворюють зв'язок вуглець-кисень. До них відноситься група ферментів, відомих як амінокислота-тРНК-лігази (аміноацил-тРНК-синтетази). які каталізують реакції взаємодії амінокислот та відповідних транспортних РНК. У цих реакціях утворюються активні форми амінокислот, здатні брати участь у процесі синтезу білка на рибосомах. Прикладом ферменту може бути тирозил-тРНК-синтетаза (L-тирозин:тРНК-лігаза (АМФ-утворююча), КФ 6.1.1.1), що бере участь у реакції: Лігази, що утворюють зв'язку вуглець-сірка. Цей підклас представлений насамперед ферментами, що каталізують утворення тіоефірів жирних кислот з коензимом А. За участю цих ферментів синтезуються ацил-КоА - активні форми жирних кислот, здатні вступати в різні реакції біосинтезу та розпаду. Розглянемо одну з реакцій активації жирних кислот, що протікає у присутності ферменту ацил-КоА-синтетази (карбонова кислота: коензим А-лігаза (АМФ-утворююча). КФ 6.2.1.2): Лігази, що утворюють зв'язку вуглець-азот, каталізують численні реакції введення азотовмісних груп в органічні сполуки. Прикладом може бути глутамінсинтетаза (L-глутамін:аміак-γ-лігаза (АДФ-утворююча), КФ 6.3.1.2). що бере участь у знешкодженні токсичного продукту обміну - аміаку - у реакції з глутаміновою кислотою: Лігази, що утворюють зв'язок вуглець-вуглець. З цих ферментів найбільш вивчені карбоксилази, що забезпечують карбоксилювання ряду сполук, у результаті відбувається подовження вуглецевих ланцюгів. Найважливішим представником цього класу є піруваткарбоксилаза (піруват:СО2-лігаза (АДФ-утворююча), КФ 6.4.1.1), що прискорює реакцію утворення оксалоацетату - ключової сполуки циклу трикарбонових кислот та біосинтезу вуглеводів: Нагадаємо, що реакції за участю АТФ каталізуються не тільки ферментами VI класу, але й деякими ферментами класу II (фосфотрансферазами або кіназами). Важливо вміти вирізняти ці типи реакцій. Їхня відмінність полягає в тому, що в трансферазних реакціях АТФ є донором фосфатних груп , тому в цих реакцію немає виділення Н3 РО4 (приклади див. вище). Навпаки, у синтетазних реакціях АТФ служить джерелом енергії , виділяється при її гідролізі, тому одним із продуктів такої реакції буде неорганічний орто-або пірофосфат.

Розділ 7.7.1	Правила роботи з ферментами
Ферменти, як і всі білки, є відносно нестійкими речовинами. Вони легко піддаються денатурації та інактивації. Тому під час роботи з ними необхідно виконувати певні умови. При зберіганні об'єкта вивчення понад кілька годин за кімнатної температури фермент майже повністю инактивируется. Тому аналіз визначення активності ферменту слід проводити у можливі короткі терміни. При необхідності тривале зберігання можливе, якщо розчин ферменту висушують із замороженого стану у високому вакуумі (ліофільна сушка). У цьому випадку фермент майже повністю зберігає активність при подальшому зберіганні при кімнатній температурі. Деякі ферменти добре зберігаються в концентрованих розчинах солей, наприклад, насиченому сульфаті амонію (процес висолювання). При необхідності осад ферменту можна відцентрифугувати і розчинити у фізіологічному розчині або буфері. Якщо необхідно, від надлишку солі можна позбутися діалізом. Необхідно пам'ятати про чутливість ферментів до коливань рН середовища. За невеликим винятком більшість ферментів інактивується в розчинах з рН нижче 5 або вище 9, а оптимум дії ферментів з'являється в зоні кількох одиниць або десятих частин одиниці значення рН. Визначення рН буферних розчинів, що використовуються під час роботи з ферментами, рекомендується проводити дуже точно за допомогою рН-метра. Ферменти легко руйнуються сильнодіючими реагентами: кислотами, лугами, окислювачами, солями важких металів. Необхідно працювати з хімічно чистими реактивами та бідистильованою водою, тому що навіть невелике забруднення реактивів, особливо домішкою металів, які можуть діяти як модулятори, призводить до зміни активності ферменту. При роботі з ферментами як ніде обов'язково суворе дотримання стандартизації умов дослідження: точне витримування температурного та тимчасового режимів, використання реактивів з однієї партії, а при зміні реактивів треба знову відкалібрувати дані. Якщо забарвлення, що розвивається, в кольоровій реакції нестійке в часі, необхідно суворо дотримуватися термінів фотометрування. Рекомендується працювати в умовах достатнього ступеня насичення ферменту субстратом, так як ця обставина суттєво позначається на кінцевому результаті, недолік субстрату нівелює різницю між варіантами. Під час роботи з ферментами необхідно враховувати органоспецифічний ізоферментний спектр. Часто така специфічність стосується умов дії ензиму. На перебіг реакції може вплинути різна спорідненість до субстрату, інша чутливість до рН, властиві ізоензим того чи іншого органу або тканини. Переносити метод дослідження активності ферменту з одного об'єкта на інший (наприклад, з сироватки на тканину або з одного органу на інший) потрібно вкрай обережно, з урахуванням усіх відомих даних про фермент та його множинні форми, а також з ретельною перевіркою результатів. Для широкого застосування різних біохімічних (ферментативних) реакцій вводиться автоматизація найбільш загальновизнаних та необхідних аналізів, а також уніфікація та стандартизація лабораторних тестів. Це раціонально і необхідно як підвищення точності, якості проведення проб, так порівняння даних, отримані у різних лабораторіях. Загальноприйнятим є і обов'язкове паралельне дослідження, поряд з патологією, що вивчається, фізіологічного контролю - групи практично здорових для встановлення нормальних, фізіологічних коливань. Розуміючи відносність поняття «нормальна величина», слід прийняти, що для виявлення відмінностей у патології та оцінки патологічної ознаки, за «норму», як правило, приймається середня арифметична М±1σ або 2σ (при нормальному Гауссовому розподілі) залежно від ступеня коливання показника .

Розділ 7.7.2	Принципи визначення активності ферментів у біологічному матеріалі.
5.6.2. Унікальна властивість ферментів прискорювати хімічні реакції може бути використана для кількісного визначення вмісту цих біокаталізаторів у біологічному матеріалі (тканинному екстракті, сироватці крові тощо). При правильно підібраних експериментальних умовах майже завжди існує пропорційність між кількістю ферменту і швидкістю реакції, що каталізується, тому по активності ферменту можна судити про кількісний вміст його в досліджуваній пробі. Вимірювання ферментативної активності ґрунтується на порівнянні швидкості хімічної реакції у присутності активного біокаталізатора зі швидкістю реакції у контрольному розчині, в якому фермент відсутній або інактивований. Досліджуваний матеріал поміщають в інкубаційне середовище, де створено оптимальні температури, рН середовища, концентрації активаторів та субстратів. Одночасно здійснюють постановку контрольної проби, яку фермент не додають. Через деякий час реакцію зупиняють шляхом додавання різних реагентів (змінюють рН середовища, що викликають денатурацію білків тощо) та проводять аналіз проб. Щоб визначити швидкість ферментативної реакції, необхідно знати: різницю концентрацій субстрату або продукту реакції до і після інкубації; час інкубації; кількість матеріалу, взяте для аналізу. Найчастіше активність ферменту оцінюють за кількістю продукту реакції, що утворився. Так роблять, наприклад, щодо активності аланінамінотрансферази, що каталізує наступну реакцію: Активність ферменту можна розраховувати також з кількості витраченого субстрату. Як приклад можна навести спосіб визначення активності -амілази - ферменту, що розщеплює крохмаль. Вимірявши вміст крохмалю в пробі до і після інкубації та обчисливши різницю, знаходять кількість субстрату, розщепленого за час інкубації.

Розділ 7.7.3	Методи виміру активності ферментів
Існує велика кількість методів вимірювання активності ферментів, що розрізняються за технікою виконання, специфічністю, чутливістю. Найчастіше для визначення застосовуються фотоелектроколориметричні методи . В основі цих методів лежать кольорові реакції з одним із продуктів дії ферментів. При цьому інтенсивність фарбування одержуваних розчинів (виміряна на фотоелектроколориметрі) пропорційна кількості продукту, що утворився. Наприклад, у процесі реакцій, що каталізуються амінотрансферазами, накопичуються α-кетокислоти, які дають з 2,4-дінітрофенілгідразином сполуки червоно-бурого кольору: Якщо досліджуваний біокаталізатор має низьку специфічність дії, то можна підібрати такий субстрат, в результаті реакції з яким утворюється забарвлений продукт. Прикладом може бути визначення лужної фосфатази - ферменту, широко поширеного в тканинах людини, його активність у плазмі істотно змінюється при захворюваннях печінки і кісткової системи. Цей фермент у лужному середовищі гідролізує велику групу фосфорнокислих ефірів, як природних, і синтетичних. Одним із синтетичних субстратів є паранітрофенілфосфат (безбарвний), який у лужному середовищі розщеплюється на ортофосфат та паранітрофенол (жовтого кольору). За ходом реакції можна спостерігати, вимірюючи поступово наростаючу інтенсивність фарбування розчину: Для ферментів, що мають високу специфічність дії, такий підбір субстратів, як правило, неможливий. Спектрофотометричні методи засновані на зміні ультрафіолетового спектру хімічних речовин, що беруть участь у реакції. Більшість сполук поглинає ультрафіолетові промені, причому довжини хвиль, що поглинаються, характерні для присутніх в молекулах цих речовин певних груп атомів. Ферментативні реакції викликають внутрішньомолекулярні перегрупування, у яких змінюється ультрафіолетовий спектр. Ці зміни можна реєструвати на спектрофотометрі. Спектрофотометричними методами, наприклад, визначають активність окислювально-відновних ферментів, що містять як кофермент НАД або НАДФ. Ці коферменти діють як акцептори або донори атомів водню і, таким чином, або відновлюються або окислюються в процесах метаболізму. Відновлені форми цих коферментів мають ультрафіолетовий спектр із максимумом поглинання при 340 нм, окислені форми цього максимуму не мають. Так, при дії лактатдегідрогенази на молочну кислоту відбувається перенесення водню на НАД, що призводить до збільшення поглинання НАДН при 340 нм. Величина цього поглинання в оптичних одиницях пропорційна кількості відновленої форми коферменту, що утворилася. За зміною вмісту відновленої форми коферменту можна визначити активність ферменту. Флюориметричні методи. В основі цих методів лежить явище флюоресценції, яке полягає в тому, що об'єкт, що досліджується, під впливом опромінення випромінює світло з більш короткою довжиною хвилі. Флюориметричні методи визначення активності ферментів чутливіші, ніж спектрофотометричні. Порівняно новими та ще більш чутливими є хемілюмінесцентні методи із застосуванням люциферин-люциферазної системи. Такі методи дозволяють визначати швидкість реакцій, що протікають із заснуванням АТФ. При взаємодії люциферину (карбонової кислоти складної будови) з АТФ утворюється люцифериладенілат. Ця сполука окислюється за участю ферменту люциферази, що супроводжується світловим спалахом. Вимірюючи інтенсивність світлових спалахів, вдається визначати кількості АТФ порядку кількох пікомолей (10-12 моль). Титрометричні методи . Низка ферментативних реакцій супроводжується зміною рН інкубаційної суміші. Прикладом такого ферменту є ліпаза підшлункової залози. Ліпаза каталізує реакцію: Утворені жирні кислоти можуть бути відтитровані, причому кількість лугу, витрачене на титрування, буде пропорційно кількості жирних кислот, що виділилися, і, отже, активності ліпази. Визначення активності цього ферменту має клінічне значення. Манометричні методи засновані на вимірі в закритому реакційному посудині обсягу газу, що виділився (або поглиненого) в ході ензиматичної реакції. За допомогою таких методів були відкриті та вивчені реакції окисного декарбоксилювання піровиноградної та α-кетоглутарової кислот, що протікають з виділенням СО2. Нині ці методи використовуються рідко.

Розділ 7.7.4	Одиниці активності ферментів та його застосування.
Міжнародна комісія з ферментів запропонувала за одиницю активностібудь-якого ферменту приймати таку кількість ферменту, яка за заданих умов каталізує перетворення одного мікромолю (10-6 моль) субстрату в одиницю часу (1 хв, 1 годину) або одного мікроеквівалента порушеної групи у тих випадках, коли атакується більше однієї групи у кожній молекулі субстрату (білки, полісахариди та інші). Повинна бути вказана температура, за якої проводиться реакція. Результати вимірювань активності ферментів можуть бути виражені в одиницях загальної, питомої та молекулярної активності. За одиницю загальної активності ферменту у розрахунку на кількість матеріалу, взятого для дослідження. Так, активність аланінамінотрансферази в печінці щурів дорівнює 1670 мкмоль пірувата на годину на 1 г тканини; активність холінестерази у сироватці крові людини становить 250 мкмоль оцтової кислоти на годину на 1 мл сироватки при 37°C. Особливої ​​уваги дослідника вимагають високі значення активності ферменту як і нормі, і у патології. Рекомендується працювати з невеликими показниками активності ферменту. Для цього джерело ферменту беруть у меншій кількості (сироватку розводять у кілька разів фізіологічним розчином, а для тканини готують менший відсотковий гомогенат). Стосовно ферменту у разі створюються умови насичення субстратом, що сприяє прояву його істинної активності. Загальна активність ферменту розраховується за допомогою формули: де а- активність ферменту (загальна), ΔС- різниця концентрацій субстрату до та після інкубації; В- кількість матеріалу, взятого на аналіз, t- Час інкубації; n- Розведення. Слід пам'ятати, що показники активності ферментів сироватки крові та сечі, досліджуваних у діагностичних цілях, виражають у одиницях загальної активності. Оскільки ферменти є білками, важливо знати як загальну активність ферменту в досліджуваному матеріалі, а й ферментативну активність білка, що у даній пробі. За одиницю питомої активності приймають таку кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату на одиницю часу у розрахунку на 1 мг білка проби. Для обчислення питомої активності ферменту необхідно загальну активність поділити вміст білка в пробе: Що гірше очищений фермент, то більше в пробі перебуває сторонніх баластних білків, тим нижче питома активність. У ході очищення кількість таких білків зменшується, відповідно питома активність ферменту підвищується. Припустимо, у вихідному біологічному матеріалі, що є джерелом ферменту (подрібнена печінка, кашка з рослинної тканини), питома активність дорівнювала 0,5 мкмоль/(мг білка × хв). Після дробового осадження сульфатом амонію та гель-фільтрації через сефадекс вона підвищилася до 25 мкмоль/мг білка× хв, тобто. збільшилася у 50 разів. До оцінки ефективності очищення ферментних препаратів вдаються під час виробництва лікарських засобів ензиматичної природи. Питому активність визначають у разі, коли необхідно зіставити активність різних препаратів однієї й тієї ж ферменту. Якщо потрібно порівняти активність різних ферментів, розраховують молекулярну активність. Молекулярна активність (або число оборотів ферменту) - це кількість моль субстрату, що піддається перетворенню під дією 1 моль ферменту в одиницю часу (зазвичай 1 хвилину). Різним ферментам властива неоднакова молекулярна активність. Зменшення кількості оборотів ферментів відбувається під впливом неконкурентних інгібіторів. Змінюючи конформацію каталітичного центру ферменту, ці речовини знижують спорідненість ферменту субстрату, що призводить до зменшення кількості молекул субстрату, реагуючих з однією молекулою ферменту в одиницю часу.

Приклади	Навчальні завдання та зразки їх вирішення.
1. Завдання 1. Які ферменти називають рацемазами? 2. Розшифруйте систематичну назву ферменту (окремо для кожного з елементів, виділених різними кольорами): S-аденозилметіонін:гуанідинацетат- метил трансфераза? Визначте: а) тип реакції; б) клас ферменту; в) підклас. 2. Еталони рішення 1. Рацемази – ферменти, що каталізують взаємоперетворення оптичних ізомерів, що містять єдиний асиметричний атом вуглецю (див. розділ 2.3). 2. Систематична назва ферменту читається з кінця. Фермент належить до класу трансфераз, що каталізує реакцію перенесення мітильної групи на гуанідинацетат (акцептор метильної групи) з S-аденозилметіоніну (донор метильної групи) (див. розділи 2.2 – 2.3). 3. а) У цій реакції відбувається розщеплення речовини без участі молекул води б) Негідролітичне розщеплення субстрату з утворенням двох продуктів каталізують ферменти, що належать до четвертого класу (ліази) в) Розривається зв'язок між першим і другим вуглецевими атомами, що призводить до відщеплення карбоксильної групи у вигляді СО2. Отже, підклас ферменту - вуглець-вуглець-ліази(Див. розділ 2.3).

У клітині будь-якого живого організму протікають мільйони хімічних реакцій. Кожна їх має велике значення, тому важливо підтримувати швидкість біологічних процесів високому рівні. Практично кожна реакція каталізується своїм ферментом. Що таке ферменти? Яка їхня роль у клітці?

Ферменти. Визначення

Термін "фермент" походить від латинського fermentum – закваска. Також вони можуть називатися ензимами від грецького en zyme – "у дріжджах".

Ферменти - біологічно активні речовини, тому будь-яка реакція, що протікає у клітині, не обходиться їх участі. Ці речовини виконують роль каталізаторів. Відповідно, будь-який фермент має дві основні властивості:

1) Ензим прискорює біохімічну реакцію, але не витрачається.

2) Величина константи рівноваги не змінюється, лише прискорюється досягнення цього значення.

Ферменти прискорюють біохімічні реакції у тисячу, а деяких випадках у мільйон разів. Це означає, що за відсутності ферментативного апарату все внутрішньоклітинні процеси практично зупиняться, а клітина загине. Тому роль ферментів як біологічно активних речовин є великою.

Різноманітність ензимів дозволяє різнобічно регулювати метаболізм клітини. У кожному каскаді реакцій бере участь безліч ферментів різних класів. Біологічні каталізатори мають велику вибірковість завдяки певній конформації молекули. ензими в більшості випадків мають білкову природу, вони знаходяться в третинній або четвертинній структурі. Пояснюється це знову ж таки специфічністю молекули.

Функції ензимів у клітці

Головне завдання ферменту – прискорення відповідної реакції. Будь-який каскад процесів, починаючи з розкладання пероксиду водню і до гліколізу, вимагає присутності біологічного каталізатора.

Правильна робота ферментів досягається високою специфічністю до певного субстрату. Це означає, що каталізатор може прискорювати лише певну реакцію і ніяку більше, навіть дуже схожу. За ступенем специфічності виділяють такі групи ензимів:

1) Ферменти з абсолютною специфічністю, коли каталізується лише одна-єдина реакція. Наприклад, колагеназа розщеплює колаген, а мальтаза розщеплює мальтозу.

2) Ферменти із відносною специфічністю. Сюди входять такі речовини, які можуть каталізувати певний клас реакцій, наприклад, гідролітичне розщеплення.

Робота біокаталізатора починається з моменту приєднання активного центру до субстрату. При цьому говорять про комплементарну взаємодію на кшталт замку та ключа. Тут мається на увазі повний збіг форми активного центру із субстратом, що дає можливість прискорювати реакцію.

Наступний етап полягає у протіканні самої реакції. Її швидкість зростає завдяки впливу ферментативного комплексу. Зрештою ми отримуємо ензим, який пов'язаний із продуктами реакції.

Заключний етап - від'єднання продуктів реакції від ферменту, після чого активний центр знову стає вільним для чергової роботи.

Схематично роботу ферменту кожному етапі можна записати так:

1) S + E -> SE

2) SE -> SP

3) SP -> S + P , де S - це субстрат, E - фермент, а P - продукт.

Класифікація ферментів

В організмі людини можна знайти безліч ферментів. Всі знання про їхні функції та роботу були систематизовані, і в результаті з'явилася єдина класифікація, завдяки якій можна легко визначити, навіщо призначений той чи інший каталізатор. Тут представлено 6 основних класів ензимів, а також приклади деяких підгруп.

1. Оксидоредуктази.

Ферменти цього класу каталізують окисно-відновлювальні реакції. Усього виділяють 17 підгруп. Оксидоредуктази зазвичай мають небілкову частину, представлену вітаміном чи гемом.

Серед оксидоредуктаз часто зустрічаються такі підгрупи:

а) Дегідрогенази. Біохімія ферментів-дегідрогеназ полягає у відщепленні атомів водню та перенесенні їх на інший субстрат. Ця підгрупа найчастіше зустрічається у реакціях дихання, фотосинтезу. У складі дегідрогеназу обов'язково присутній кофермент у вигляді НАД/НАДФ або флавопротеїдів ФАД/ФМН. Нерідко трапляються іони металів. Прикладами можуть бути такі ензими, як цитохромредуктази, піруватдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, і навіть багато ферментів печінки (лактатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа тощо. буд.).

б) оксидази. Ряд ферментів каталізує приєднання кисню до водню, у результаті продуктами реакції можуть бути вода або пероксид водню (H 2 0, H 2 0 2). Приклади ферментів: цитохромоксідаза, тирозиназа.

в) Пероксидази та каталази - ензими, що каталізують розпад H 2 O 2 на кисень та воду.

г) оксигенази. Ці біокаталізатори прискорюють приєднання кисню до субстрату. Дофамінгідроксилаза - один із прикладів таких ензимів.

2. Трансферази.

Завдання ферментів цієї групи полягає у перенесенні радикалів від речовини-донора до речовини-реципієнта.

а) Метилтрансферази. ДНК-метилтрансферази - основні ферменти, що контролюють процес реплікації нуклеотидів відіграє велику роль у регуляції роботи нуклеїнової кислоти.

б) Ацилтрансферази. Ензими цієї підгрупи транспортують ацильную групу з однієї молекули в іншу. Приклади ацилтрансфераз: лецитинхолестеринацилтрансфераза (переносить функціональну групу з жирної кислоти на холестерин), лізофосфатидилхолинацилтрансфераза (ацильна група переноситься на лізофосфатидилхолін).

в) Амінотрансферази – ферменти, які беруть участь у перетворенні амінокислот. Приклади ферментів: аланінамінотрансфераза, яка каталізує синтез аланіну з пірувату та глутамату шляхом перенесення аміногрупи.

г) фосфотрансферази. Ферменти цієї підгрупи каталізують приєднання фосфатної групи. Інша назва фосфотрансфераз, кінази зустрічається набагато частіше. Прикладами можуть служити такі ензими, як гексокінази та аспартаткинази, які приєднують фосфорні залишки до гексозів (найчастіше до глюкози) та аспарагінової кислоти відповідно.

3. Гідролази – клас ензимів, які каталізують розщеплення зв'язків у молекулі з наступним приєднанням води. Речовини, що належать до цієї групи, – основні ферменти травлення.

а) Естерази – розривають ефірні зв'язки. Приклад – ліпази, які розщеплюють жири.

б) Глікозидази. Біохімія ферментів цього ряду полягає у руйнуванні глікозидних зв'язків полімерів (полісахаридів та олігосахаридів). Приклади: амілаза, цукроза, мальтаза.

в) Пептидази – ензими, що каталізують руйнування білків до амінокислот. До пептидазів належать такі ферменти, як пепсини, трипсин, хімотрипсин, карбоїксипептидаза.

г) Амідази – розщеплюють амідні зв'язки. Приклади: аргіназа, уреаза, глутаміназа і т. д. Багато ферментів-амідази зустрічаються в

4. Ліази - ферменти, що за функцією схожі з гідролазами, проте при розщепленні зв'язків у молекулах не витрачається вода. Ензими цього класу завжди мають у складі небілкову частину, наприклад у вигляді вітамінів В1 або В6.

а) Декарбоксілази. Ці ферменти діють на З-З зв'язок. Прикладами можуть бути глутаматдекарбоксилаза або піруватдекарбоксилаза.

б) Гідратази та дегідратази – ферменти, які каталізують реакцію розщеплення зв'язків С-О.

в) Амідин-ліази – руйнують С-N зв'язки. Приклад: аргінінсукцинатліаза.

г) Р-О ліази. Такі ферменти зазвичай відщеплюють фосфатну групу від речовини-субстрату. Приклад: аденілатциклаз.

Біохімія ферментів заснована на їх будову

Здібності кожного ензиму визначаються індивідуальною, тільки йому властивою будовою. Будь-який фермент - це, насамперед, білок, та її структура і рівень згортання грають вирішальну роль визначенні його функції.

Для кожного біокаталізатора характерна наявність активного центру, який, у свою чергу, поділяється на кілька самостійних функціональних областей:

1) Каталітичний центр - це спеціальна область білка, через яку відбувається приєднання ферменту до субстрату. Залежно від конформації білкової молекули, каталітичний центр може набувати різноманітної форми, яка повинна відповідати субстрату так само, як замок ключу. Така складна структура пояснює те, що перебуває у третинному чи четвертинному стані.

2) Адсорбційний центр – виконує роль «власника». Тут насамперед відбувається зв'язок між молекулою ферменту та молекулою-субстратом. Проте зв'язки, які утворює адсорбційний центр, дуже слабкі, отже, каталітична реакція цьому етапі оборотна.

3) Алостеричні центри можуть розташовуватися як у активному центрі, і по всій поверхні ферменту загалом. Їх функція – регулювання роботи ензиму. Регулювання відбувається за допомогою молекул-інгібіторів та молекул-активаторів.

Активаторні білки, зв'язуючись із молекулою ферменту, прискорюють його роботу. Інгібітори ж, навпаки, загальмовують каталітичну активність, причому це може відбуватися двома способами: або молекула зв'язується з алостеричним центром в області активного центру ферменту (конкурентне інгібування), або вона приєднується до іншої області білка (неконкурентне інгібування). вважається дієвішим. Адже при цьому закривається місце для зв'язування субстрату з ферментом, причому цей процес можливий лише у разі практично повного збігу форми молекули інгібітору та активного центру.

Ензим часто складається не тільки з амінокислот, але і з інших органічних та неорганічних речовин. Відповідно, виділяють апофермент – білкову частину, кофермент – органічну частину, та кофактор – неорганічну частину. Кофермент може бути представлений вуглеводами, жирами, нуклеїновими кислотами, вітамінами. У свою чергу кофактор - це найчастіше допоміжні іони металів. Активність ферментів визначається його будовою: додаткові речовини, що входять до складу, змінюють каталітичні властивості. Різноманітні види ферментів – це результат комбінування всіх перерахованих факторів утворення комплексу.

Регулювання роботи ферментів

Ензими як біологічно активні речовини не завжди потрібні організму. Біохімія ферментів така, що вони можуть у разі надмірного каталізу зашкодити живій клітині. Для запобігання згубному впливу ензимів на організм необхідно якимось чином регулювати їхню роботу.

ферменти мають білкову природу, вони легко руйнуються при високих температурах. Процес денатурації оборотний, однак він може суттєво вплинути на роботу речовин.

pH також грає велику роль у регуляції. Найбільша активність ферментів, зазвичай, спостерігається при нейтральних значеннях pH (7,0-7,2). Також є ензими, які працюють лише у кислому середовищі або лише у лужному. Так, у клітинних лізосомах підтримується низький pH, у якому активність гідролітичних ферментів максимальна. У разі їх випадкового попадання в цитоплазму, де середовище вже ближче до нейтрального, їхня активність знизиться. Такий захист від «самопоїдання» заснований на особливостях роботи гідролазу.

Варто згадати про значення коферменту та кофактора у складі ферментів. Наявність вітамінів чи іонів металу суттєво впливає на функціонування деяких специфічних ензимів.

Номенклатура ферментів

Всі ферменти організму прийнято називати залежно від їхньої приналежності до якогось із класів, а також по субстрату, з яким вони вступають у реакцію. Іноді використовують у назві не один, а два субстрати.

Приклади назви деяких ензимів:

1. Ферменти печінки: лактат-дегідрогеназа, глутамат-дегідрогеназа.
2. Повна систематична назва ферменту: лактат-НАД+-оксидоредукт-аза.

Збереглися і тривіальні назви, які дотримуються правил номенклатури. Прикладами є травні ферменти: трипсин, хімотрипсин, пепсин.

Процес синтезу ферментів

Функції ферментів визначаються ще генетичному рівні. Оскільки молекула за великим рахунком - білок, то і її синтез точно повторює процеси транскрипції та трансляції.

Синтез ферментів відбувається за наступною схемою. Спочатку з ДНК зчитується інформація про необхідний ензим, внаслідок чого утворюється мРНК. Матрична РНК кодує всі амінокислоти, що входять до складу ензиму. Регуляція ферментів може відбуватися і на рівні ДНК: якщо продукту реакції, що каталізується, достатньо, транскрипція гена припиняється і навпаки, якщо виникла потреба в продукті, активізується процес транскрипції.

Після того як мРНК вийшла у цитоплазму клітини, починається наступний етап – трансляція. На рибосомах ендоплазматичної мережі синтезується первинний ланцюжок, що складається з амінокислот, з'єднаних пептидними зв'язками. Проте молекула білка у первинній структурі ще може виконувати свої ферментативні функції.

Активність ферментів залежить від структури білка. На тій же ЕПС відбувається скручування протеїну, у результаті утворюються спочатку вторинна, а потім третинна структури. Синтез деяких ферментів зупиняється вже на цьому етапі, проте для активізації каталітичної активності часто необхідно приєднання коферменту та кофактору.

У певних областях ендоплазматичної мережі відбувається приєднання органічних складових ензиму: моносахаридів, нуклеїнових кислот, жирів, вітамінів. Деякі ферменти що неспроможні працювати без наявності коферменту.

Кофактор грає вирішальну роль в освіті Деякі функції ферментів доступні лише при досягненні білком доменної організації. Тому для них дуже важлива наявність четвертинної структури, в якій сполучною ланкою між декількома глобулами білка є іон металу.

Множинні форми ферментів

Зустрічаються ситуації, коли потрібна наявність кількох ензимів, що каталізують одну й ту саму реакцію, але відрізняються один від одного за будь-якими параметрами. Наприклад, фермент може працювати при 20 градусах, проте за 0 градусів він вже не зможе виконувати свої функції. Що робити у подібній ситуації живому організму за низьких температур середовища?

Ця проблема легко вирішується наявністю відразу декількох ферментів, що каталізують ту саму реакцію, але працюють у різних умовах. Існують два типи множинних форм ензимів:

1. Ізоферменти. Такі білки кодуються різними генами, складаються з різних амінокислот, проте каталізують ту саму реакцію.
2. Справжні множинні форми. Ці білки транскрибуються з одного й того ж гена, проте на рибосомах відбувається модифікація пептидів. На виході отримують кілька форм одного й того ж ферменту.

В результаті перший тип множинних форм сформований на генетичному рівні, коли другий – на посттрансляційному.

Значення ферментів

У медицині зводиться до випуску нових лікарських засобів, у складі яких речовини вже у потрібних кількостях. Вчені ще не знайшли спосіб стимулювання синтезу відсутніх ензимів в організмі, проте сьогодні широко поширені препарати, які можуть на якийсь час заповнити їх недолік.

Різні ферменти в клітині каталізують велику кількість реакцій, пов'язаних із підтриманням життєдіяльності. Одними з таких енізмів є представники групи нуклеаз: ендонуклеази та екзонуклеази. Їхня робота полягає у підтримці постійного рівня нуклеїнових кислот у клітині, видаленні пошкоджених ДНК та РНК.

Не слід забувати про таке явище, як згортання крові. Будучи ефективним заходом захисту, цей процес перебуває під контролем низки ферментів. Головним є тромбін, який переводить неактивний білок фібриноген в активний фібрин. Його нитки створюють своєрідну мережу, яка закупорює місце ушкодження судини, тим самим перешкоджаючи надмірній крововтраті.

Ферменти використовуються у виноробстві, пивоварінні, отриманні багатьох кисломолочних продуктів. Для отримання спирту з глюкози можуть використовуватися дріжджі, однак для вдалого протікання цього процесу достатньо екстракту з них.

Цікаві факти, про які ви не знали

Усі ферменти організму мають велику масу - від 5000 до 1000000 Так. Це з наявністю білка у складі молекули. Для порівняння: молекулярна маса глюкози – 180 Так, а вуглекислого газу – всього 44 Так.

На сьогоднішній день відкрито більш ніж 2000 ферментів, які були виявлені у клітинах різних організмів. Проте більшість із цих речовин до кінця ще не вивчено.

Активність ферментів використовують для отримання ефективних пральних порошків. Тут ензими виконують ту ж роль, що і в організмі: вони руйнують органічні речовини, і ця властивість допомагає у боротьбі з плямами. Рекомендується використовувати подібний пральний порошок за температури не вище 50 градусів, інакше може піти процес денатурації.

За статистикою, 20% людей по всьому світу страждає від нестачі якогось із ферментів.

Про властивості ензимів знали дуже давно, проте тільки в 1897 люди зрозуміли, що для зброджування цукру в спирт можна використовувати не самі дріжджі, а екстракт з їх клітин.

ФЕРМЕНТИ, органічні речовини білкової природи, які синтезуються у клітинах й у багато разів прискорюють які у них реакції, не піддаючись у своїй хімічним перетворенням. Речовини, що мають подібну дію, існують і в неживій природі і називаються каталізаторами.

Ферменти (від латів. fermentum – бродіння, закваска) іноді називають ензимами (від грец. en – усередині, zyme – закваска). Усі живі клітини містять дуже великий набір ферментів, від каталітичної активності яких залежить функціонування клітин. Практично кожна з багатьох різноманітних реакцій, що протікають у клітині, вимагає участі специфічного ферменту. Вивченням хімічних властивостей ферментів і реакцій, що каталізуються, займається особлива, дуже важлива область біохімії – ензимологія.

Багато ферментів знаходяться в клітині у вільному стані, будучи просто розчинені в цитоплазмі; інші пов'язані із складними високоорганізованими структурами. Є й ферменти, які в нормі знаходяться поза клітиною; так, ферменти, що каталізують розщеплення крохмалю та білків, секретуються підшлунковою залозою в кишечник.Секретують ферменти та багато мікроорганізмів.

Дія ферментів

Ферменти, що беруть участь у фундаментальних процесах перетворення енергії, таких як розщеплення цукрів, утворення і гідроліз високоенергетичного з'єднання аденозинтрифосфату (АТФ), присутні в клітинах всіх типів - тварин, рослинних, бактеріальних. Проте є ферменти, які утворюються лише у тканинах певних організмів.

Так, ферменти, що у синтезі целюлози, виявляються у рослинних, але з тварин клітинах. Таким чином, важливо розрізняти «універсальні» ферменти та ферменти, специфічні для тих чи інших типів клітин. Взагалі, чим більше клітина спеціалізована, тим більша ймовірність, що вона синтезуватиме набір ферментів, необхідний для виконання конкретної клітинної функції.

Особливістю ферментів є те, що вони мають високу специфічність, тобто можуть прискорювати лише одну реакцію або реакції одного типу.

У 1890 Е. Г. Фішер припустив, що ця специфічність обумовлена ​​особливою формою молекули ферменту, яка точно відповідає формі молекули субстрату.Ця гіпотеза дістала назву «ключа і замка», де ключ порівнюється із субстратом, а замок – із ферментом. Гіпотеза каже: субстрат підходить до ферменту, як ключ підходить до замку. Вибірковість дії ферменту пов'язана із будовою його активного центру.

Активність ферментів

Насамперед, на активність ферменту впливає температура. З підвищенням температури швидкість хімічної реакції зростає. Збільшується швидкість молекул, вони з'являються більше шансів зіштовхнутися друг з одним. Отже, збільшується ймовірність, що реакція між ними відбудеться. Температура, що забезпечує найбільшу активність ферменту, - оптимальна.

Поза оптимальної температури швидкість реакції знижується внаслідок денатурації білків. Коли температура знижується, швидкість хімічної реакції також падає. Коли температура досягає точки замерзання, фермент інактивується, але при цьому не денатурує.

Класифікація ферментів

У 1961 році було запропоновано систематичну класифікацію ферментів на 6 груп. Але назви ферментів виявилися дуже довгими і важкими у вимові, тому ферменти прийнято сьогодні називати з допомогою робочих назв. Робоча назва складається з назви субстрату, який діє фермент, і закінчення «аза». Наприклад, якщо речовина - лактоза, тобто молочний цукор, то лактаза - це фермент, який його перетворює. Якщо сахароза (звичайний цукор), то фермент, що його розщеплює, – сахараза. Відповідно, ферменти, які розщеплюють протеїни, звуться протеїнази.