Atvirkštinė transkriptazė (revertazė). Atvirkštinė transkriptazė (revertazė) Kokiame procese naudojamas fermentas atvirkštinė transkriptazė

Tiriant retrovirusus, kurių genomą reprezentuoja vienos grandinės RNR molekulės, buvo nustatyta, kad intracelulinio vystymosi procese jie pereina savo genomo integravimo dvigrandės DNR pavidalu į šeimininko chromosomas stadiją. ląstelė. 1964 metais X. Teminas iškėlė hipotezę apie virusui būdingo fermento, galinčio sintetinti RNR šablone papildomą DNR, egzistavimą. 1970 metais X. Teminas ir S. Mizutani, taip pat nepriklausomai D. Baltimore'as atrado tokį fermentą tarpląstelinio Rouso sarkomos viruso virionų preparate. Ši nuo RNR priklausoma DNR polimerazė vadinama atvirkštine transkriptaze (atvirkštine transkriptaze).

Paukščių retrovirusų revertazė buvo ištirta išsamiau. Kiekviename virione yra apie 50 šio fermento molekulių. Atvirkštinė transkriptazė susideda iš dviejų subvienetų, ά (65 kDa) ir β (95 kDa), esančių ekvimoliniais kiekiais. ά-subvienetas yra N-galinė dalis (du trečdaliai) β-subvieneto.

Atvirkštinė transkriptazė turi mažiausiai tris fermentines veiklas:

DNR polimerazė, naudojant RNR ir DNR kaip šabloną;

RNazės H, hidrolizuojančios RNR RNR-DNR hibride, bet ne viengrandę ar dvigrandę RNR, aktyvumą;

DNR endonukleazė.

Pirmosios dvi veiklos reikalingos viruso DNR sintezei, o endonukleazė, atrodo, yra svarbi viruso DNR integracijai į šeimininko ląstelės genomą. Reversetazės β-subvienetas turi visas tris veiklas, o ά-subvienetas turi tik polimerazę ir Rnazę H.

Išgryninta atvirkštinė transkriptazė sintezuoja DNR tiek RNR, tiek DNR šablonuose. Norint pradėti sintezę, reversetazei, kaip ir kitoms polimerazėms, reikia trumpos dvigrandės srities – pradmenų. Pradmuo gali būti viengrandis tiek RNR, tiek DNR segmentas, kuris reakcijos eigoje kovalentiškai susijungia su naujai susintetinta DNR grandine.

Atvirkštinė transkriptazė daugiausia naudojama transkribuoti pasiuntinio RNR į komplementarią DNR (cDNR). Atvirkštinės transkripcijos reakcija atliekama esant stipriems RNazės aktyvumo inhibitoriams. Tokiu atveju galima gauti viso ilgio tikslinių RNR molekulių DNR kopijas. Oligo(dT) naudojamas kaip poli(A) turinčios mRNR atvirkštinės transkripcijos pradmenys (pav.), o RNR molekulėms, kurios neturi 3" poli(A) galų, chemiškai susintetinti oligonukleotidai, papildantys 3" galą. studijavo RNR. Be to, pastarojo tipo RNR molekulės gali būti konvertuojamos į turinčias poli(A), naudojant E. coli poli(A) polimerazę.

Atlikus papildomos DNR grandinės sintezės mRNR ir RNR sunaikinimą (dažniausiai naudojamas apdorojimas šarmais), susintetinama antroji DNR grandinė. Šiuo atveju naudojamas reversetazės gebėjimas suformuoti save papildančius plaukų segtukus 3 "viengrandinės cDNR galuose, kurie gali veikti kaip pradmuo. Pirmoji cDNR grandinė tarnauja kaip šablonas. Šią reakciją galima katalizuoti. tiek reversetaze, tiek E. coli DNR polimeraze I. Šių dviejų fermentų derinys leidžia padidinti pilnaverčių dvigrandžių cDNR molekulių išeigą.

Pasibaigus sintezei, pirmoji ir antroji cDNR gijos lieka kovalentiškai sujungtos plaukų segtuko kilpa, kuri tarnavo kaip antrosios krypties sintezės pradmuo. Ši kilpa suskaidoma S1 endonukleaze, kuri specifiškai naikina vienos grandinės nukleorūgščių sritis. Gauti galai ne visada būna buki, o siekiant padidinti vėlesnio klonavimo efektyvumą, jie pataisomi iki buki naudojant E. coli DNR polimerazės I Klenow fragmentą. Tada gauta dvigrandė cDNR gali būti įterpta į klonavimo vektorius, dauginama kaip hibridinės DNR molekulės ir naudojama tolesniems tyrimams.

Atvirkštinė transkriptazė (reversetazė arba nuo RNR priklausoma DNR polimerazė) yra fermentas, kuris katalizuoja DNR sintezę RNR šablone procese, vadinamame „ atvirkštinė transkripcija“. Proceso pavadinimas atspindi proceso priešingybę transkripcijos atliekama kita kryptimi: iš DNR šablono molekulės sintetinamas RNR nuorašas.

Šie fermentai buvo išskirti iš RNR virusų ( retrovirusai). Naviko virusai naudoja atvirkštinę transkriptazę, kad transkribuotų mRNR į papildomą DNR grandinę. Tiriant retrovirusus, kurių genomą reprezentuoja vienos grandinės RNR molekulės, buvo nustatyta, kad intracelulinio vystymosi procese retrovirusas pereina savo genomo integravimo dvigrandės DNR pavidalu į chromosomas stadiją. ląstelė šeimininkė. 1964 m. Teminas iškėlė hipotezę apie virusui būdingo fermento, galinčio sintetinti papildomą DNR RNR šablone, egzistavimą. Pastangos, skirtos išskirti tokį fermentą, buvo sėkmingos, o 1970 m. Teminas ir Mizutanis, taip pat nepriklausomai nuo jų, Baltimorė atrado norimą fermentą tarpląstelinio Rouso sarkomos viruso virionų preparate. Ši nuo RNR priklausoma DNR polimerazė vadinama atvirkštine transkriptaze arba revertaze.

Paukščių retrovirusų revertazė buvo ištirta išsamiau. Kiekviename virione yra apie 50 šio fermento molekulių. Atvirkštinė transkriptazė susideda iš dviejų subvienetų – a (65 kDa) ir b (95 kDa), kurių yra ekvimoliniais kiekiais. Atvirkštinė transkriptazė turi mažiausiai tris fermentines veiklas:

1) DNR polimerazė, naudojant RNR ir DNR kaip šabloną;

2) RNazės H, kuri hidrolizuoja RNR kaip RNR-DNR hibrido dalį, aktyvumas;

3) DNR endonukleazės aktyvumas.

Pirmosios dvi veiklos reikalingos viruso DNR sintezei, o endonukleazė, atrodo, yra svarbi viruso DNR integracijai į šeimininko ląstelės genomą. Išgryninta atvirkštinė transkriptazė sintezuoja DNR tiek RNR, tiek DNR šablonuose (11 pav.).

Ryžiai. 11. RNR molekulių dvigrandžių DNR kopijų sintezės schema

Norint pradėti sintezę, reversetazei, kaip ir kitoms polimerazėms, reikia trumpos dvigrandinės srities (pradmens). Pradmuo gali būti viengrandis tiek RNR, tiek DNR segmentas, kuris reakcijos eigoje kovalentiškai susijungia su naujai susintetinta DNR grandine. Genų inžinerijoje naudojami ir oligo-(dT) pradmenys, papildantys mRNR 3'-poliA galus, ir heksanukleotidų rinkinys, „atsitiktinis“ sudėtimi ir seka (atsitiktiniai pradmenys). Dažnai RNR molekulėms, kurių pirminė seka žinoma, neturi 3'-poli (A) galų, naudokite chemiškai susintetintus oligonukleotidus, papildančius 3" galą

Atvirkštinė transkriptazė dažniausiai naudojama perrašant RNR pasiuntinį į komplementarią DNR (cDNR). Atvirkštinės transkripcijos reakcija atliekama specialiai parinktomis sąlygomis, naudojant stiprius RNazės aktyvumo inhibitorius. Tokiu atveju galima gauti tikslinių RNR molekulių viso ilgio DNR kopijas. Po papildomos DNR grandinės sintezės mRNR ir RNR sunaikinimo (dažniausiai naudojamas apdorojimas šarmais), atliekama antrosios DNR grandinės sintezė. Šiuo atveju naudojamas reversetazės gebėjimas suformuoti savarankiškai papildančius plaukų segtukus viengrandinės cDNR 3' galuose, kurie gali veikti kaip pradmenys.

Šablonas yra pirmoji cDNR grandinė. Šią reakciją gali katalizuoti ir revertazė, ir E. coli DNR polimerazė I. Įrodyta, kad šių dviejų fermentų derinys leidžia padidinti pilnų dvigrandžių cDNR molekulių išeigą. Pasibaigus sintezei, pirmoji ir antroji cDNR gijos lieka kovalentiškai sujungtos plaukų segtuko kilpa, kuri tarnavo kaip antrosios krypties sintezės pradmuo. Ši kilpa suskaidoma S1 endonukleaze, kuri specifiškai naikina vienos grandinės nukleorūgščių sritis. Gauti galai ne visada būna buki, o siekiant padidinti vėlesnio klonavimo efektyvumą, jie pataisomi iki buki naudojant E. coli DNR polimerazės I Klenow fragmentą. Tada gauta dvigrandė cDNR gali būti įterpta į klonavimo vektorius, dauginama kaip hibridinės DNR molekulės ir naudojama tolesniems tyrimams.

Revertazė yra fermentas, sintezuojantis cDNR RNR šablone.

Kai kurių virusų genomas yra ne DNR, kaip įprasta, o RNR. Tokie virusai buvo vadinami retrovirusais (retro – atvirkštiniai). 1970 metais D.Baltimore'as ir H.M.Teminas atrado informacijos perdavimo iš viruso RNR į DNR mechanizmą, t.y. priešingai nei vyksta ląstelėse aukštesni organizmai. Šis procesas vadinamas atvirkštine transkripcija, o jį vykdantis fermentas vadinamas atvirkštine transkriptaze arba revertaze.

Atvirkštinė transkriptazė arba revertazė (atvirkštinė transkriptazė, [lat. transkripcija- perrašymas) - nuo RNR priklausoma DNR polimerazė, kurios pagalba atliekama atvirkštinė transkripcija - DNR sintezė RNR šablone; koduoja kai kurių RNR turinčių virusų genomai ir aukštesniųjų organizmų genomo mobilieji genetiniai elementai – svarbus genų inžinerijos „įrankis“. Atvirkštinė transkriptazė turi mažiausiai tris fermentines veiklas:

1) DNR polimerazė, naudojant RNR ir DNR kaip šabloną;

2) Rnazės H, kuri hidrolizuoja RNR RNR ir DNR hibride, bet ne viengrandėje ar dvigrandėje RNR, aktyvumą ir

3) DNR endonukleazės aktyvumas.

1970 m. nepriklausomai atrado D. Baltimore ir H. Temin RNR turinčiuose naviko virusuose (1975 m. Nobelio premija, kartu su R. Dulbecco).

Taigi, atvirkštinės transkriptazės gali sintetinti DNR ant RNR šablono, polimerizavusios keturis dezoksiribonukleozidų trifosfatus. Ir kaip ir DNR polimerazės, jos veikia tik esant sėklai.

Atvirkštinės transkriptazės naudojamos dvigrandės DNR, papildančios RNR (ypač mRNR), sintezei, vėliau ją klonuojant plazmidiniuose vektoriuose, siekiant gauti cDNR bibliotekas (klonotekus). Atvirkštinės transkriptazės, kaip ir DNR polimerazės, gali būti naudojamos radioaktyviajai arba fluorescencinei etiketei įterpti į DNR zondus tinkamai pažymėtuose dezoksiribonukleozidų trifosfatuose.

Įrodytas termostabilios Thermus thermophilus DNR polimerazės gebėjimas susintetinti DNR iš RNR šablono tam tikromis sąlygomis. Tai leidžia jį naudoti tiesioginiam specifinių RNR aptikimui biologiniuose mėginiuose naudojant PGR. Šiuolaikinės šio metodo modifikacijos leidžia viename reakcijos mišinyje (ir mėgintuvėlyje) atvirkštinės transkripcijos reakcijos metu susintetinti nedidelį skaičių amplifikuoto DNR fragmento kopijų RNR šablone, kurias tas pats fermentas iš karto panaudoja kaip šabloną. atliekant įprastą PGR (vieno mėgintuvėlio PGR).